El estudio se realizó en el laboratorio de microbiología de la Universidad Nacional Agraria, ubicado en el km 12 carretera norte Managua, Nicaragua a una altitud de 56 m.s.n.m entre las coordenadas 86°09′36″ de longitud Oeste y 12°08′15″ de latitud norte.

El tipo de estudio fue descriptivo de corte transversal.

La unidad de producción de bovinos de la Facultad de Ciencia Animal cuenta con una población de 22 bovinos de la raza Reyna a los que se les realizo toma de muestra sanguínea la que consistió en localizar la vena coccígea, luego se desinfectó esta área con alcohol al 70 % y se extrajo 3 ml de sangre total con una jeringa de 5 ml , posteriormente se depositó la sangre en un tubo de ensayo que contenía 50 µl del anti-coagulante ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en concentración de 10.8 mg. Las muestras fueron trasladadas en un recipiente térmico a temperatura de 6-8 ^oC al laboratorio de microbiología de la facultad de agronomía. Los criterios de inclusión de los bovinos fueron: hembras bovinas en edades entre 1-6 años, clínicamente sanos (no hay alteración de la tríada clínica), hembras en producción y libres de enfermedades como la brucelosis y la tuberculosis.

Para la extracción de ADN se utilizó el método CTAB (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio) descrito por Doyle y Doyle (1990) el que consiste en calentar el buffer de extracción CTAB por 30 minutos a 65 ºC. En vez de tejido vegetal se colocó 50µl de sangre total con EDTA 10.8 mg en un tubo Eppendorf y se adiciono 500 μl de CTAB 2% (buffer) y 1 μl de RNasa y se incubo 65^oC por 30 minutos. Posterior a la incubación, se adicionaron 400 μl de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), se centrifugó por 10 minutos a 14 000 rpm. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf de 1.5 ml, se agregó nuevamente cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y se centrifugó por 5 minutos a 14 000 rpm. El sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo Eppendorf de 1.5 ml, se adicionaron 200 μl de isopropanol, se incubó por 15 minutos a -20 °C, se centrifugó a 14 000 rpm por 15 minutos y se eliminó el sobrenadante. Al pellet resultante se le adicionaron 100 μl de etanol mezclando por inversión, se centrifugó a 14 000 rpm por 4 minutos, se eliminó el sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente. Posteriormente, el pellet fue suspendido en 100 μl de agua calidad molecular o Tris-EDTA (TE) buffer, se adicionó 1μl de la ribonucleasa ARN-asa y se incubó por 20 minutos a 37 ºC. El ADN extraído se mantuvo a una temperatura de -20 ^oC hasta su uso.

La amplificación del gen de la Kappa caseína se realizó mediante la técnica de PCR convencional con reacciones de 25 µl de volumen, la que consistió en mezclar 2 µl de la muestra a estudiar 12.5 µl de Master Mix (PROMEGA), 7.5 µl de agua libre de nucleasas y 2 µl del par de cebadores BLKC delantero 5`- ATT AGCCCATTTCGCCTTCT-3` y BLKC-reverso 5`-ATT TATGGCCATTCCACCAA-3`, respectivamente que producen un amplicón de 351 pb (Rojas, 2009).

Se realizó en un termociclador Eppendorf bajo las siguientes condiciones: Desnaturalización inicial 94 °C durante 5 minutos, 35 ciclos a 94 °C durante 45 segundos 52.4 °C por 45 segundos seguido de 72 °C por 60 segundos y una extensión final a 72 °C durante 7 minutos. Para visualizar los fragmentos se colocaron 8 µl del producto PCR con 1.5µl del colorante de carga 6x loading Dye en un gel de agarosa al 1% teñido con Gel red. El gel se colocó en una cámara de electroforesis con buffer TBE 1X. La electroforesis se llevó a cabo por un periodo de una hora a 80 voltios y luego se procedió a visualizar en el transluminador registrándose los resultados fotográficamente.

La genotipificación se realizó mediante la técnica PCR-FRLP usando el producto de la amplificación de la PCR con los iniciadores BLKC delantero y BLKC-reverso. El producto de la PCR se sometió a digestión con la enzima Hinf I en un volumen final de 10 µl. El procedimiento consistió en adicionar 8 µl del producto amplificado PCR, 2 µl de la enzima de restricción. Posteriormente se incubo a 37 °C por una hora en un termociclador Eppendorf. Después de la incubación se procedió a realizar la separación de los fragmentos en un gel de agarosa al 1 % en solución de Tris-Borato-EDTA buffer 1X. Los genotipos AA mostraron dos fragmentos de 134/132 pb y 84 pb, los genotipos BB presentaron dos fragmentos de 266 pb y 84 pb, mientras que los genotipos AB presentaron tres fragmentos de 266 pb 134/132pb y 84 pb.

La frecuencia génica o frecuencia alélica consiste en la proporción de cada alelo en un locus dado en una población específica. La suma de las frecuencias alélicas en una población siempre es 1 o 100% (Griffiths et al., 1990). Se calculó la frecuencia genotípica y alélica mediante las fórmulas propuestas por Hernández y Trejo (2014).

Frecuencia genotípica

Frecuencia alélica

Donde:

N: Número de muestra

p(A): Frecuencia del alelo A

q(B): Frecuencia del alelo B

AB: Heterocigotos de los alelos A y B

0.5: Constante de la mitad de cada alelo

Se amplificaron fragmentos de 351pb correspondiente al gen de la К-caseína con el par de cebadores específicos BLKC delantero 5`- ATT AGCCCATTTCGCCTTCT-3` y BLKC-reverso 5`-ATT TATGGCCATTCCACCAA-3`, en veintidós muestras procedentes de hembras bovinos (Figura 1). Las veintidós muestras procesadas, presentaron buena calidad del ADN genómico, lo que significa que estaban aptas para ser digeridas por la enzima de restricción Hinf I.

Figura 1. Figura 1. Producto PCR amplificado con los cebadores BLKC-delantero/ BLKC-reverso del gen de la к-caseína en muestras de hembras bovinas identificadas por los números (1,2,3,4,5,7,8 y 9). Con la letra M se indica el marcador molecular de 100pb.

El producto PCR de las veintidós muestras amplificadas con los cebadores BLKC-delantero / BLKC-reverso, para el gen de la к-caseína fueron sometidos a digestión con la enzima de restricción Hinf I, determinándose patrones de bandas de 134/132 pb y 84 pb para el genotipo homocigótico AA en dos muestras, dos fragmentos de 266 pb y 84 pb para el genotipo homocigótico dominante BB en una muestra y tres fragmentos de 266 pb 134/132 pb, y 84pb correspondiente al genotipo heterocigótico AB en 19 muestra (Figura 2). Estos resultados son parecidos a los encontrados por Cortés-López et al., (2012) quienes obtuvieron 37 individuos homocigóticos dominantes (AA), 70 heterocigóticos (AB) y un individuo homocigótico recesivo (BB).

Requena et al. (2007); Uffo et al. (2006) y Benavides, (2003), platean que el genotipo homocigótico BB del gen de Kappa caseína estudiada en bovinos, presenta un contenido proteico más alto, posee mayor estabilidad al calor y a la congelación, menor tiempo de coagulación y un cuajo más consistente, trayendo consigo un rendimiento quesero entre el 5 y el 10%, lo cual hace que la leche sea más rentable para la industria quesera.

Estudio realizado por Rojas (2009), indican que el alelo A es el que prevalece en las razas Holstein, Friesian, Ayrshire, Danés Rojo y Cebú Índico, a diferencia del alelo B que predomina en las razas Jersey, Normando y Cebú Africano. En estudios de caracterización molecular de razas bovinas, se ha observado que el alelo B presenta mayores frecuencias en las razas Bos taurus en comparación con las razas Bos indicus (Golijow et al., 1999; Kemenes et al., 1999; Tambasco, 1998 y Del Lama y Zago, 2002).

Figura 2 Figura 2 Patrones de bandas del gen de la kappa caseína obtenidos después de la digestión del producto PCR con la enzima de restricción Hinf I. Con la letra M se indica el marcador molecular de 100pb. las muestras números 5,9,10,11,13 y 17 corresponden a los individuos con genotipos AB, mientras que el número 7 al genotipo AA y el numero 15 al genotipo BB.

Las frecuencias genotípicas obtenidas fueron 0.090 (2/22), 0.045 (1/22) y 0.0863 (19/22) para los genotipos AA, BB y AB, respectivamente, siendo el genotipo más frecuente el AB seguido del AA y el menos frecuente el BB, mientras que la frecuencia alélica fue 0.52 y 0.48 para los alelos A y B, respectivamente, siendo el más frecuente el alelo A (Cuadro 1). Estos resultados son similares a los obtenidos por (Almeyda et al., 2016) los cuales obtuvieron una frecuencia alélica de 0.55 para el alelo A y 0.44 para el alelo B.

La leche producida por bovinos con el genotipo CASK BB presentan propiedades de interés para la manufactura del queso por presentar menor tiempo de renina, cuajo más firme y mayor contenido de proteínas y sólidos. Es importante conocer el estatus actual de los alelos de la kappa caseína en la raza estudiada, lo que permitirá determinar los genotipos predominantes y sus frecuencias, para realizar selección de aquellos genotipos deseados en la población Eenennaam y Medrano (1991).

En este estudio los resultados obtenidos fueron diferentes a los de Dogru y Ozdemir (2009), quien estudió bovinos de la raza Pardo Suizo, identificando frecuencias genotípicas de 0.1935, 0.2043 y 0.6022 para los genotipos AA, BB y AB, respectivamente. La frecuencia alélica fue de 0.495 y 0.505 para los alelos A y B respectivamente, indicando mayor número de genotipos AB y BB, mientras tanto la frecuencia de alelos predomino el B, un factor determinante puede ser la raza bovina estudiada.

Cuadro 1.

A: Alelo A, B: Alelo B, AA: Homocigotos A, BB: Homocigotos B y AB: Heterocigotos AB.

La leche derivada de animales CASκ AA tiene menor porcentaje de κ-caseína y como consecuencia de esto, una mayor proporción de micelas grandes, por el contrario, la leche de animales CASκ BB presenta mayor proporción de κ-caseína y micelas más pequeñas. Esta característica explica la formación de un cuajo más firme y una mayor retención de sólidos, lo que resulta en un rendimiento superior durante la producción de queso, comparada con la leche producida por animales con genotipo CASκ AA (Requena et al., 2007).

Eenennaam y Medrano (1991) demostraron que la leche de los animales con genotipo CASκ AB contiene una mayor proporción de κ-CN B, esto sugiere que dicho alelo tiene un mayor nivel de expresión con respecto a la variante A en la glándula mamaria de los bovinos.