La determinación de frecuencias alélicas y genotípicas del gen de Kappa caseína y ßeta-Lactoglobulina se realizó en el laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional Agraria, Facultad de Agronomía (UNA), ubicada en el km 12 1/2 Carretera Norte Managua, Nicaragua, con coordenadas 86°09′36″ de longitud Oeste y 12°08′15″ de latitud Norte, como lo indica el Instituto Nicaragüense de Estudios Territoriales (INETER, 2018).

Esto estudio se realizó de manera descriptiva y consistió en determinar las frecuencias alélicas y genotípicas del gen Kappa caseína y ßeta Lactoglobulina del ganado bovino antes señalado.

La población bovina estudiada fue de 20 hembras con encaste de 75 % Pardo Suizo y 25 % Brahmán. La toma de muestra sanguínea fue venosa, mediante la localización de la vena coccígea, se levantó la cola del animal con suavidad hasta colocarla en posición vertical, sujetándola en el tercio medio posterior, desinfectando el área con alcohol al 70 % y extrayendo 2 ml de sangre total con una jeringa de 5 ml; luego se depositó la sangre en un tubo de ensayo que contiene anti coagulante EDTA en concentración de 10.8 mg, posteriormente se invirtió varias veces el tubo para que la sangre y el anticoagulante se mezclarán (Zambrano y Díaz, 2012). Las muestras fueron trasladadas en un recipiente térmico al laboratorio de microbiología de la Facultad de Agronomía.

La selección de hembras bovinas en esta investigación fue por conveniencia, tomando como criterio de inclusión hembras en edades de 12 a 18 meses, clínicamente sanas (sin alteraciones en frecuencia respiratoria, frecuencia cardíaca y temperatura), reproductivamente sanas, libres de tuberculosis y brucelosis.

La extracción de ADN se realizó por el método CTAB (Bromuro de hexadeciltrimetilamonio) descrito por Doyle y Doyle (1990), que consiste en:

Calentar el buffer de extracción CTAB por 30 minutos a 65 ºC. En vez de tejido vegetal se colocó 50 µl de sangre total con EDTA en concentración de 10.8 mg en un tubo Eppendorf y se adicionó 500 μl de CTAB 2 % (buffer) y se incubó a 65 ºC por 30 minutos. Posterior a la incubación, se adicionaron 400 μl de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), se centrifugó por 10 minutos a 14 000 rpm. Se tomó el sobrenadante y se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf de 1.5 ml, se adicionó 200 μl de isopropanol, se incubó por 15 minutos a -20 °C, se centrifugó a 14 000 rpm por cinco minutos y se eliminó el sobrenadante. Al pellet resultante se le adicionó 100 μl de etanol y se mezcló por inversión, se centrifugó a 14 000 rpm por tres minutos, se eliminó el sobrenadante y se dejó secar a temperatura ambiente. Posteriormente, el pellet fue hidratado en 100 μl de agua calidad molecular, se adicionó 1 μl de la ribonucleasa (ARNasa) y se incubó por 20 minutos a 37 ºC. El ADN extraído se mantuvo a una temperatura de -20 ºC hasta su uso.

La amplificación del gen de la Κappa caseína se realizó mediante la técnica de PCR convencional con reacciones de 25 µl de volumen final, que consistió en mezclar 2 µl de la muestra a estudiar 12.5 µl de Master Mix (PROMEGA), 7.5 µl de agua libre de nucleasas y 2 µl del par de cebadores utilizados por Rojas et al. (2009), BLKC delantero 5`- ATT AGCCCATTTCGCCTTCT-3` y BLKC-reverso 5`-ATT TATGGCCATTCCACCAA-3`, respectivamente que producen un amplicón de 351 pares de bases(pb). La PCR se desarrolló en un termociclador Eppendorf bajo las siguientes condiciones: Desnaturalización inicial 95 ºC durante tres minutos, 35 ciclos a 94 ºC durante 45 segundos 52.4 ºC por 45 segundos seguido de 72 ºC por 60 segundos y una extensión final a 72 ºC durante siete minutos. Para visualizar los fragmentos se depositó 8 µl del producto PCR con 1.5 µl del colorante de carga 6x loading Dye en un gel de agarosa al 2 % teñido con Gel red. El gel se colocó en una cámara de electroforesis con buffer TBE 1X. La electroforesis se llevó a cabo por un periodo de una hora a 80 voltios a 85 miliamperios luego se procedió a visualizar las bandas en el transluminador registrándose los resultados fotográficamente.

La amplificación del gen de βeta Lactoglobulina se realizó mediante la técnica de PCR convencional con reacciones de 25 µl de volumen final, la que consistió en mezclar 2 µl de la muestra a estudiar, 12.5 µl de Master Mix (PROMEGA), 7.5 µl de agua libre de nucleasas y 2 µl del par de cebadores utilizados por Rojas et al. (2010 ), BLGP3-F 5´ GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA-3´y BLGP4-reversa 5´-CAGGACACCGG-CTCCCGGTATATGA-3´, respectivamente que producen un amplicon de 262 pb. La PCR se desarrolló en un termociclador Eppendorf bajo las siguientes condiciones: Desnaturalización inicial 95 ºC durante tres minutos, 35 ciclos a 94 0C durante 45 segundos, 64.2 0C por 45 segundos seguido de 72 ºC por 60 segundos y una extensión final a 72 ºC por siete minutos. Para visualizar los fragmentos se depositó 8 µl del producto PCR con 1.5 µl del colorante de carga 6x loading Dye en un gel de agarosa al 2 % teñido con Gel red. El gel se colocó en una cámara de electroforesis con buffer TBE 1X. La electroforesis se llevó a cabo por un periodo de una hora y treinta minutos a 80 voltios a 85 miliamperios, luego se procedió a visualizar las bandas en el transluminador registrándose los resultados fotográficamente.

La genotipificación se realizó mediante la técnica PCR-FRLP que consiste en:

Usar el producto de la amplificación de la PCR con los iniciadores BLKC delantero y BLKC-reverso. El producto de la PCR convencional se sometió a digestión con la enzima Hinf I en un volumen final de 10 µl. El procedimiento consistió en adicionar 8 µl del producto amplificado PCR, 2 µl de la enzima de restricción. Posteriormente se incubó a 37 ºC por una hora en un termociclador Eppendorf. Después de la incubación se procedió a realizar la separación de los fragmentos en un gel de agarosa al 2 % en solución de Tris -Borato-EDTA buffer 1X. Los genotipos homocigotos AA mostraron dos fragmentos de 134/132 pb y 84 pb, los genotipos homocigotos BB dos fragmentos de 266 pb y 84 pb, mientras que los genotipos heterocigotos AB presentaron tres fragmentos de 266pb, 134/132pb y 84 pb (Rojas et al., 2009, p. 646).

La genotipificación de ßeta Lactoglobulina se realizó mediante la técnica PCR-FRLP que consiste en:

Usar el producto de la amplificación de la PCR con los iniciadores BLGP3 delantero y BLGP4 reverso. El producto PCR se sometió a digestión con enzima Hae III en un volumen final de 10 µl. El procedimiento consistió en adicionar 8 µl del producto amplificado PCR, 2 µl de la enzima de restricción. Posteriormente se incubó a 37 ºC por una hora en un termociclador Eppendorf. Después de la incubación se procedió a realizar separación de los fragmentos en un gel de agarosa al 2 % en solución de Tris -Borato-EDTA buffer 1X. Los genotipos homocigotos AA mostraron dos fragmentos de 153/109 pb y 109 pb, los genotipos heterocigotos AB presentaron tres fragmentos de 153, 109 y 74/79 pb mientras que los genotipos homocigotos BB mostraron dos fragmentos de 109 y 74/79 pb (Rojas et al., 2009, p. 177).

Consistió en calcular la proporción de cada alelo en un locus determinado en una población específica, el resultado de la suma de las frecuencias alélicas en una población siempre se expresa con un valor igual a uno o como 100 % (Griffiths, 2002; Falconer y Mackey, 2001). Se calculó la frecuencia genotípica y alélica mediante las fórmula descrita por Hernández-Rodríguez y Trejos-Mendinilla, (2014).

Frecuencia alélica

Donde:

Nº: Número de muestras

p(A): Frecuencia del alelo A

q (B): Frecuencia del alelo B

AB: Heterocigotos de los alelos A y B

0.5: Constante de la mitad de cada alelo

Las variables fueron la determinación de frecuencias alélicas y genotípicas de los alelos Kappa caseína y Beta-globulina a partir de los resultados de la PCR y PCR-FRLPs.

La frecuencia génica o alélica se estiman contando el número de veces que es observado el alelo de un locus, dividiéndolo entre el número de alelos estudiados (Hernández y Trejo, 2014).

Para obtener el porcentaje de las frecuencias genotípica se divide cada número de combinaciones observadas (genotipo) entre el número total de la muestra analizada y posteriormente multiplicándolo por 100 (Hernández y Trejos, 2014).

Los datos obtenidos fueron analizados a través de una hoja de Excel para el cálculo de las frecuencias alélicas y genotípicas de las hembras muestreadas, utilizando las fórmulas de Hernández y Trejos (2014).

Con la técnica PCR se amplificaron fragmentos de 351 pb correspondiente al gen de la Κappa caseína con el par de cebadores BLKC delantero y BLKC-reverso en 20 muestras de hembras bovinas con encaste Pardo Suizo Brahmán (Figura 1). La amplificación de los fragmentos fue óptima para ser digeridos con la enzima de restricción Hinf I (Figura 1).

Producto de la digestión con la enzima de restricción Hinf I se determinó el genotipo AA en cinco muestras, observándose patrones de banda de 134/132 pb y 84 pb, en una muestra se observaron fragmentos de 266 pb y 84 pb correspondiendo al genotipo BB, mientras que en 11 muestras se observó el genotipo AB con fragmentos de 266 pb 134/132 pb y 84 pb (Figura 2).

Figura 1. Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa de los productos PCR del gen de К-caseína amplificado con los cebadores BLKC-delantero y BLKC-reverso en muestras de hembras bovinas, identificadas por los números (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17), la letra M indica el marcador de peso molecular de 100 pb. Elaboracion propia

Figura 2. Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa de los productos PCR del gen de К-caseína, digeridos con la enzima de restricción Hilf I. La letra M indica el marcador molecular de 100 pb, las muestras número 1, 3, 4, 5, 9, 10, 15, 16, 17 corresponden a hembras bovinas con genotipo AB, mientras que el número 2 y 14 corresponden al genotipo BB. Los números 11, 12, 13, 18 corresponden al genotipo AA. Elaboracion propia

En este estudio las frecuencias genotípicas obtenidas para el gen de Κappa caseína fueron 0.3 (6/ 20), 0.60 (12/20) y 0.10 (2/20) para los genotipos AA, AB y BB, respectivamente. El genotipo más frecuente fue el AB, seguido del AA y el menos frecuente el BB, mientras que las frecuencias alélicas fueron 0.60 y 0.40 para los alelos A y B, respectivamente, habiendo sido el alelo más frecuente el A. En relación con el gen de βeta Lactoglobulina la frecuencia genotípica fue 0.10, 0.80 y 0.10 para el genotipo AA, BB y AB respectivamente. El genotipo más frecuente el BB, seguido del AB y el AA, mientras que las frecuencias alélicas fueron 0.15 y 0.85 para los alelos A y B respetivamente, resultado el alelo más frecuente el B. EL predomino de los alelos A y B está determinada por las diferentes razas y los cruces que se realizan para mejorar el hato ganadero.

Cuadro 1. Cuadro 1. Frecuencias alélica y genotípica del gen de Κappa caseína y ßeta Lactoglobulina en hembras bovinas de la raza con encaste Pardo Suizo de la UNA

Raza	Proteína	Frecuencia alélica		Frecuencia genotípica
		A	B	AA	BB	AB
Pardo Suizo	Κappa caseína	0.60	0.40	0.30	0.10	0.60
	βeta lactoglobulina	0.15	0.85	0.10	0.80	0.10

A: Alelo A; B: Alelo B; AA: Homocigoto A; BB: Homocigoto B; y AB: Heterocigoto AB.

Estudios realizados por Lunder et al. (1997) indican que la asociación entre las variantes Caseína (CSN), la producción y composición de la leche ha sido de gran importancia en la raza europeas, determinando que la variante B de Κappa caseína ha sido reconocida como superior para la calidad en razas lecheras europeas.

Cervantes et al. (2007) reportan que el alelo A de Κappa caseína en cinco de seis poblaciones analizadas presentaron frecuencias alélicas de 0.700 para la razas Holstein x Cebú, 0.300 para Holstein, 0.702 en Pardo Suizo, 0.298 en Pardo Suizo x Cebú, 0.511 para Cebú y 0.489 en Criollo lechero tropical; en cambio el alelo B presentó frecuencias alélicas igual a 0.429 para Holstein x Cebú, 0.571 en Holstein, 0.740 para Pardo Suizo, 0.260 en Pardo Suizo x Cebú, 0.571 en Cebú y de 0.429 en Criollo lechero tropical. Obteniendo mayor frecuencia el alelo B del gen de Κappa caseína en el cruce Pardo Suizo y Cebú seguido del Pardo Suizo, por la alta presencia de este alelo hace particularmente adecuada a dichas razas para procesos industriales lácteos con composición proteica y grasa aceptables.

Los resultados de este estudio son similares a los obtenidos por Almeyda et al. (2016), quienes registraron mayor frecuencia del genotipo AB del gen Κappa caseína en el ganado criollo de Perú con 0.56 en 27 animales de 48 analizados, y una frecuencia alélica para A y B de 0.552 y 0.448 respectivamente.

En este estudio los resultados son diferentes a los de Dogru y Ozdemir (2009), quienes reportan frecuencias genotípicas de Κappa caseína de 0.1935, 0.2043 y 0.6022 para los genotipos AA, BB y AB, respectivamente. En tanto las frecuencias alélicas fueron de 0.495 y 0.505 para los alelos A y B, respectivamente, en raza Pardo Suizo, indicando mayor número de genotipos AB y BB, mientras tanto la frecuencia de alelos predominante en el B.

Van Eenennaam y Medrano (1991) demostraron que la leche de los animales con genotipo CASκ AB contiene una mayor proporción de κ-CN B. Esto sugiere que dicho alelo tiene un mayor nivel de expresión con respecto a la variante A en la glándula mamaria de los bovinos.

Los resultados en este estudio para βeta Lactoglobulina son similares a los obtenidos por Morillo et al. (2014) obteniendo frecuencias alélicas en razas criollo limonero y Carora de Venezuela con alelos A y B, para criollo limonero 0.21, 0.79 y para Carora 0.34, 0.66, respectivamente, presentando mayor frecuencia el alelo B en poblaciones bovinas Bos Taurus Bos indicus, como Cebuinas brasileñas y en razas Nórdicas. Rojas et al. (2010) determinaron frecuencias genotípicas del gen de βeta Lactoglobulina de 0.07, 0.29, 0.64 para los genotipos AA, AB, BB respectivamente, y en las frecuencias alélicas 0.22 para el alelo AA y de 0.78 para el alelo B, predominando la variante B.