Para la obtención de las muestras se seleccionaron plantas que presentaban los síntomas característicos de marchitamiento por R. solanacearum tales como marchitez a nivel de follaje, coloración verde pálida en hojas y caída de las hojas básales seguidos por la marchitez total de la planta (Ríos, 2007). El muestreo se realizó en dos reservas naturales del departamento de Estelí, ubicadas en la parte central norte del país. Se colectaron 22 muestras en la Reserva Natural Tisey (154 km al norte de Managua, capital de Nicaragua) y 26 muestras en la Reserva Natural Miraflor a 192 km de Managua. Las variedades de papa presentes en estas fincas fueron Granola, Hactri, Evora y Picasso. Las muestras consistieron en tejido vegetal y suelo; que se colocaron en bolsas plásticas, con cierre hermético dentro de una hielera para ser trasladadas al laboratorio de microbiología y fueron almacenadas a 4 ^oC, previamente al aislamiento bacteriano.

Se realizó la prueba de flujo bacteriano, la que consistió en realizar cortes transversales, desinfectarlos con hipoclorito de sodio al 1 % y lavarlos con agua destilada estéril (ADE). Posteriormente los trozos de tallo se sumergieron en ADE y se observó la presencia o ausencia de un hilo blanco, que consiste en el flujo bacteriano (Perea et al., 2011). Con las muestras de suelo se utilizó la técnica de dilución seriada. Se preparó una solución madre a partir de 10 g de suelo y 90 ml de agua destilada estéril, en un Erlenmeyer de 150 ml, a partir de la cual se prepararon las diluciones 10^-3, 10^-4 y 10^-5 (Agrios, 1997).

El flujo bacteriano obtenido del tejido vegetal fue inoculado con una asa bacteriológica en el medio de cultivo agar cloruro de tetrazolium (TZC); las placas petri fueron incubadas a 30 °C. Después de 48 horas de incubación se observaron las características macroscópicas (tamaño, forma, superficie, bordes, color y producción de pigmento) del crecimiento bacteriano (Kelman, 1954). En el caso de aislamiento de suelo se utilizaron las diluciones 10^-3, 10^-4 y 10^-5, las que fueron inoculadas el medio de cultivo agar cloruro de tetrazolium (TZC 1 %), depositando la cantidad de 100 µl en cada plato petri. Se realizaron pruebas bioquímicas de oxidasa, catalasa y KOH 3 % para determinar la presencia de la bacteria según su reacción (Schaad et al., 2001).

Para la identificación de biovares se realizó prueba individual de carbohidratos, observando las reacciones de oxidación–fermentación a partir de los disacáridos Lactosa, Maltosa y Celobiosa, y la oxidación de las hexosas alcohólicas Dulcitol, Manitol y Sorbitol. Los tubos de ensayo que contenían los carbohidratos fueron examinados a los 3, 7, 14 y 28 días después de la inoculación. El cambio de coloración en el medio de purpura a amarillo indicaron resultados positivos (Schaad et al., 2001; French et al., 1995).

Las razas fueron caracterizadas en plantas individuales de tabaco (prueba de hipersensibilidad), se preparó una suspensión bacteriana a partir de cultivos puros con 24-48 horas de incubación y agua destilada estéril hasta obtener una concentración de 1 x 10⁸ UFC (unidades formadoras de colonia), (0.5 solución escala Mackfarland), posteriormente se hicieron orificios sobre el haz de la hoja en zonas intervenales con una aguja hipodérmica N° 29; se inoculó la suspensión bacteriana con una jeringa sin aguja, apoyando la jeringa sobre la superficie de la hoja y presionando por debajo con los dedos. Los resultados se monitorearon en un periodo de 12 a 96 horas, observando síntomas como clorosis, marchitamiento y reacción de hipersensibilidad. Según Lozano y Sequeira (1970) la raza 1 causa clorosis a los dos días después de la inoculación y marchitamiento típico después de 7-8 días, la raza 2 causa clorosis a los dos días después de la inoculación y marchitamiento típico después de 7-8 días, mientras que la raza 3 provoca reacción hipersensitiva 12-24 horas después de la inoculación.

Se realizó mediante prueba de difusión de discos de Bauer et al. (1966) que consiste en la medición y observación visual del tamaño y forma de los halos de inhibición producida por la sinergia entre los discos de antibióticos Cefoxitina (FOX), Cefepima (FEP), Ceftazidima (CAZ) Amoxicilina más ácido clavulánico (AMC), Ampicilina (AMP), Meropenem (MER), Imepenem (IMP) e inductor EDTA. Los aislados de R. solanacearum con ausencia de halo o halo menor a 14 mm indica que son resistentes a Cefoxitina, debido a la presencia de AmpC; en el caso de observar aplastamiento en la zona de sinergia con AMC indica resistencia a CAZ y a FEP, debido a la presencia de betalactamasas de espectro extendido (BLEE). La utilización en este estudio de Meropenem e Imepinem fue para descartar la posibilidad de aislados con presencia de Carbapenemasas (Clinical and Laboratory Standards Institute, 2016).

Se obtuvieron 29 muestras negativas de R. solanacearum y 19 aislados positivos, 11 aislados de la Reserva Natural Miraflor y ocho de la Reserva Natural Tisey; ya que manifestaron reacciones positivas a las pruebas de oxidasa, catalasa y KOH 3 %, además se caracterizaron macroscópicamente por las colonias de crecimiento acuoso grandes, blancas y centro de color rosado en el medio cultivo TZC al 1 % de Kelman. Estos permitieron identificar 14 aislados pertenecientes al biovar 1, los cuales mostraron reacciones negativas en cada uno de los carbohidratos utilizados (Lactosa, Maltosa, Celobiosa, Dulcitol, Manitol y Sorbitol), y cinco identificados como biovar 3 que mostraron reacciones positivas en cada carbohidrato, según French et al. (1995). En este estudio tuvo mayor incidencia el biovar 1 en comparación con el biovar 3.

Figura 1. Figura 1. Aislados de Ralstonia solanacearum en medio de cultivo TZC 1 %.

Los resultados de la prueba de hipersensibilidad en planta de tabaco (Lozano y Sequeira 1970), indican que pasadas 48 horas después de la infiltración se observó clorosis en la zona infiltrada, ocho días después se observó marchitamiento de las plantas. Estas características indican que los aislados pertenecen a la raza 1.

Figura 2. Figura 2. Caracterización de aislados de R. solanacearum procedentes de muestras de suelo y tejido vegetal del cultivo de papa. Clorosis a partir de las 48 horas posteriores a la infiltración (A y B), y marchitamiento a partir de los siete y ocho días posteriores a la infiltración (C y D).

Los resultados de este estudio tienen similitud con los datos obtenidos por Ríos (2007), quien determinó mediante pruebas de fermentación-oxidación de carbohidratos e inoculación de plantas de tabaco la presencia de raza 1, biovar 1 y biovar 3 en el cultivo de papa en zonas de Estelí, y la caracterización de razas y biovares de R. solanacearum realizado por Díaz (2005) en Nicaragua, determinó que 20 aislados pertenecían a la raza 1 biovar 3 y siete pertenecían a la raza 2 biovar 3 prevaleciendo en los sitios muestreados el biovar 3.

Estudio realizado por Chavarro y Ángel (2006), en 200 muestras colectadas del cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) y plátano (Musa paradisiaca), mediante la técnica NCM-ELISA, determinaron 36 aislamientos de R. solanacearum. Las razas y biovares se determinaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación, obteniendo como resultado agrupaciones correspondientes a la raza 3, biovar 2, en aislados de papa (Solanum tuberosum L.) y agrupaciones de raza 2, biovar 1 en aislamiento de plátano (Musa paradisiaca).

Se encontró que 12 aislados, ocho aislados de la reserva natural Miraflor y cuatro de la reserva natural Tisey, no mostraron halos de inhibición indicando la presencia del fenotipo AmpC hiperproducido (derreprimido) lo que corresponde a resistencia a Cefoxitina; mientras tanto, siete aislados fueron susceptibles a los antibióticos utilizados para determinar mecanismos de resistencia y catalogados como aislados salvajes. No se encontró presencia de aislados de R. solanacearum con presencia de Betalactamasas de espectro extendido (BLEE).

Figura 3. Figura 3. Aislados de R. solanacearum con fenotipos AmpC hiperproducido (A, B, C y D) y fenotipos salvajes (E y F) aislados de las zonas de muestreo.

Según Schmidtke y Hanson (2006), se han encontrado en plás-midos genes AmpC de diferentes orígenes genéticos, incluidos C. freundii y M. morganii. El movimiento de estos genes en plásmidos aumentó la prevalencia de este mecanismo de resistencia mediante la diseminación del gen en organismos gramnegativos que naturalmente no portan genes que codifiquen AmpC, como Salmonella spp. y Klebsiella pneumoniae, además confirma que el gen AmpD es un mecanismo involucrado en la sobreproducción de AmpC que conduce a un fenotipo dereprimido y una enzima importante en la vía de reciclaje de la pared célula.

Tans-Kersten et al. (2000), demuestran la presencia del gen AmpD en la bacteria Ralstonia solanacearum, que codifica para la enzima AmpD, que consiste en una amidasa citoplasmática (N-acetilmuramil-L-alanina amidasa), además proponen la posibilidad que AmpD realice otras funciones desconocidas en la célula bacteriana, tales como factor de virulencia para el marchitamiento bacteriano o bien podría funcionar como autolisina durante patogénesis de la marchitez bacteriana.