Las muestras de suelo se recolectaron en las fincas Marino, San José y Félix ubicadas en el municipio de Masatepe. Dichas muestras se tomaron en cinco puntos diferentes de cada finca, cerca de la zona de goteo a una profundidad de 20 cm. El suelo colectado se depositó en bolsas plásticas con capacidad de 2.2 kg y se trasladó al laboratorio de Microbiología vegetal de la Universidad Nacional Agraria para su análisis.

Se aplicó el método de tamizado y decantación en húmedo (modificado de Gerdemann y Nicolson, 1963), así como el método de centrifugación (modificado de Jenkins, 1964) para la separación de esporas de micorrizas en muestras de suelo (Figura 1 y 2).

Figura 1. Figura 1. Método de tamizado y decantación en húmedo para separación de esporas de micorrizas en muestras de suelo.

Figura 2. Figura 2. Método de centrifugación para separación de esporas de micorrizas en muestras de suelo

Utilizando las claves taxonómicas ilustradas de González (1989) y del International Culture Collection of Vesicular Arbuscular Mycorrhizal Fungi (INVAM, 2020) se efectuó la identificación de los HMA a nivel de género a partir de las características morfológicas de las esporas.

Se utilizó un diseño completo al azar con 20 repeticiones, tres aislados más un testigo y dos portainjertos para un total de 160 plantas. El espacio entre cada variedad de portainjerto fue de un metro y entre cada unidad experimental de 0.5 m para un área total del ensayo de 320 m². Este ensayo se estableció en el Vivero de cítricos propiedad de OIRSA, ubicado en el km 30 carretera Tipitapa-Masaya, entre las coordenadas 12°07´5.8” latitud Norte y 86°05´18.3” longitud Oeste.

Se inocularon 80 plantas del portainjerto Troyer y 80 plantas del portainjerto Carrizo previamente trasplantadas en bolsas de 6 x 12 pulgadas, el sustrato utilizado fue 50 % tierra, 30 % lombrihumus y 20 % arena poma. Con ayuda de una espátula metálica se exteriorizaron las raíces para inocularlas con aproximadamente 20-25 esporas ml^-1 de micorrizas que predominaron en el proceso de identificación por finca muestreada.

Se utilizó un testigo absoluto que consistió en plantas sin inocular y al momento de exhibir las raíces se les adicionó agua destilada estéril. Las plantas evaluadas se fertilizaron según el programa de fertilización del invernadero de OIRSA.

Se utilizó el método descrito por Phillips y Hayman (1970) para determinar el porcentaje de colonización de micorrizas en las raíces de los portainjertos. De cada tratamiento se seleccionaron raíces secundarias, se lavaron con abundante agua, se procedió a clarearlas con KOH al 10 %, luego fueron blanqueadas con H₂O₂ al 10 % y finalmente teñidas con azul de Tripán al 0.05 %.

Se colocaron las raíces teñidas en laminillas, al menos 100 segmentos por tratamiento, se le agregó de una a tres gotas de Lacto glicerol en los extremos de las raíces, de manera vertical sobre la preparación luego se dejó caer suavemente un portaobjetos evitando burbujas de aire, con ayuda del microscopio óptico en el aumento de 100 X se observó la presencia de las estructuras fúngicas (hifas, vesículas o arbúsculos). Para el cálculo del porcentaje de colonización se empleó la siguiente fórmula: Porcentaje de colonización= (número de campos colonizados) / (número total de campos observados) x 100

Para determinar el efecto de las micorrizas arbusculares sobre el desarrollo vegetativo de los portainjertos Citrange Troyer y Citrange Carrizo se midieron las variables morfológicas a los 90 días después de la inoculación. Las variables morfológicas fueron: número de hojas verdaderas contabilizando todas las hojas que presentaba la planta, altura total (cm) se midió con una cinta métrica, diámetro de tallo (mm) usando un vernier y la longitud de raíz (cm) fue medido con una cinta métrica.

El porcentaje de materia seca aérea y de raíces de los portainjertos, fue determinado a partir del peso fresco y peso seco (g) medidos con una balanza analítica OHAOS después de 48 horas de secado a 80 °C. El cálculo de porcentaje de materia seca con la fórmula descrita por Vílchez (2002).

En cuanto al análisis de datos se empleó Excel 2013 para organizar los datos recolectados de las variables morfológicas; posteriormente se realizaron pruebas de análisis de varianza (α=0.05) y separación de medias de Tukey (α=0.05) con el programa estadístico InfoStat versión 2013.

El género de HMA más predominante en los análisis de muestras de suelo provenientes de fincas productoras de cítricos fue Glomus sp; en el aislado de la finca Félix se presentó en un 99 %, en la finca Marino en un 98 % y en la finca San José 97 %. Sin embargo, también se identificaron los géneros Scutellospora sp, Gigaspora sp, Septoglomus sp y Acaulospora sp con 1 % respectivamente (Figura 3). Esta predominancia se debe a que Glomus “es el género más abundante y ubicuo dentro de las micorrizas” (Arévalo, 2016), esto sugiere que este género posee mejor capacidad para adaptarse a las condiciones edafoclimáticas de las zonas productoras de cítricos.

Figura 3. Figura 3. Géneros de HMA identificados en muestras de suelo procedentes de fincas con cultivos de cítrico, Glomus sp (A) Scutellospora sp (B) Acaulospora sp (C) Septoglomus sp (D).

Se observó colonización y presencia de estructuras fúngicas (Figura 4) en las dos especies de portainjertos evaluadas; en el portainjerto Troyer, las muestras de raíces procedentes de la finca Félix alcanzaron el 93 % de colonización y un 83 % en el portainjerto Carrizo, mientras que el aislado de la finca San José colonizó el 93 % en la variedad Troyer y 100 % en la variedad Carrizo, en relación al aislado de la finca Marino el porcentaje de colonización fue de 93 % para ambos portainjertos evaluados; estos resultados justifican el uso de HMA en plantaciones de cítricos puesto que favorecen el enraizamiento, desarrollo y crecimiento de las plantas.

González et al. (2000), evaluaron sustratos de crecimiento en microplántulas de cítricos inoculadas con Glomus sp y encontraron que las raíces del portainjerto Carrizo estaban colonizadas de 47 % a 80 % en cambio las raíces del portainjerto Troyer de 37 % a 64 %.

Martinello et al. (2016) evaluaron el porcentaje de colonización de los géneros Scutelospora, Gigaspora, Glomus, Acaulospora en raíces de portainjertos de cítricos (Citrange Fepagro C37 Reck y Kumquat) y encontraron resultados similares a los reportados en este estudio.

Figura 4. Figura 4. Raíces de portainjertos Citrange Troyer (A y B) y Carrizo (C y D), colonizadas por el hongo del género Glomus sp. Hifas (1), vesículas (2) y arbúsculos (3).

Es fundamental Conocer el desarrollo vegetativo de las plantas para el manejo adecuado de éstas en la plantación, fertilización, control de plagas y enfermedades lo que al final lleva a incrementar la producción. Se evaluó el efecto de Glomus sp sobre los portainjertos Citrange Troyer y Citrange Carrizo.

Los resultados indican que existen diferencias estadísticas significativas en las variables morfológicas evaluadas para el portainjerto Citrange Troyer (Cuadro 1). Las plantas inoculadas con aislados de la finca Félix presentaron mayores valores de altura y número de hojas verdaderas; en cambio las plantas con aislados procedentes de la finca San José mostraron los mejores resultados en diámetro de tallo y longitud de raíz; las diferencias pueden ser atribuidas a las condiciones ambientales de las zonas donde se colectaron las muestras y por otro lado, estos resultados evidencian el efecto de la micorrización sobre el desarrollo vegetativo del portainjerto evaluado.

Cuadro 1. Cuadro 1. Análisis de variables morfológicas del portainjerto Citrange Troyer inoculados con los aislados de Glomus sp

Aislados	Variables morfológicas
	Altura de planta (cm)	Número de hojas	Diámetro de tallo (mm)	Longitud de raíz (cm)
Finca Félix	77.07 a	41 a	7.04 a	30.05 b
Finca San José	75.13 a	39 b	7.07 a	34.10 a
Testigo	70.23 b	35 c	6.62 b	33.05 a
Finca Marino	67.33 b	35 c	6.69 b	29.65 b
R2	0.93	0.95	0.91	0.93
p-valor	<0.00001	<0.00001	<0.00001	0.0003

Las plantas del portainjerto Citrange Carrizo (Cuadro 2) mostraron diferencias estadísticas significativas para las variables morfológicas evaluadas. Los mayores valores de altura fueron presentados en las plantas inoculadas con aislados de la finca San José; por su parte, las plantas inoculadas con los aislados de la finca Félix mostraron los mejores resultados para las variables número de hojas verdaderas, diámetro de tallo y longitud de raíz. En el porta injerto Carrizo, el aislado de la finca San José logró el mayor porcentaje de materia seca aérea foliar con 41.63 %, igual que finca Marino con 40.22 %. El menor porcentaje de materia seca aérea foliar lo obtuvo la finca Félix con 36.43 % (Figura 5).

Cuadro 2. Cuadro 2. Análisis de variables morfológicas del portainjerto Citrange Carrizo inoculados con los aislados de Glomus sp

Aislados	Variables morfológicas
	Altura de planta (cm)	Número de hojas	Diámetro de tallo (mm)	Longitud de raíz (cm)
Finca San José	34.93 a	27.33 b	4.78 a	46.50 ab
Testigo	31.67 b	23.47 c	4.22 b	42.00 c
Finca Félix	30.23 bc	42.63 a	4.95 a	46.70 a
Finca Marino	27.60 c	23.73 c	4.15 b	43.40 bc
R2	9.44	8.47	3.94	0.94
p-valor	<0.0001	<0.0001	<0.0001	<0.0008

El mayor porcentaje de materia seca de raíces lo obtuvo el testigo con 50.10 %. En relación al porta injerto Troyer no hay diferencias significativas, para el porcentaje de materia seca aérea (p=0.1545) y materia seca de raíz (p=0.0716), entre los aislados de cada finca y el testigo. Además, los resultados pueden estar influenciados por los cambios ambientales dado que estos intervienen de manera considerable en el proceso de acumulación de materia seca; el aire, la energía solar, el agua, la temperatura pueden interferir en el ritmo de producción de biomasa de una especie vegetal.

Figura 5. Figura 5. Porcentaje de materia seca en porta injertos Carrizo inoculados con Glomus sp.

Resultados similares fueron reportados por González-Mancilla et al. (2013) quienes evaluaron el efecto de diferentes tipos y dosis de fertilizantes orgánicos considerando las variables porcentaje de colonización micorrícica arbuscular, altura, diámetro basal de tallos, materia seca foliar y de raíz en plantas del portainjerto Citrange Troyer.

Aravena (2003) evaluó el efecto de la micorrización en plantas de cítricos (Citrus macrophylla y Citrange Carrizo) y Persea americana Mill. con cepas de hongos nativas (Glomus sp. y Glomus cf. claroideum) e introducida (Glomus intraradices Schenk y Smith.) y no encontró diferencias estadísticas para las variables altura de las plantas, diámetro del tallo, materia seca radicular y aérea en las especies evaluadas.

Cruz (2017) indica que “el crecimiento de una planta se representa gráficamente como un aumento del peso seco en función del tiempo” (p. 20). El análisis estadístico de las variables peso seco aéreo y peso seco de raíz muestra que existen diferencias significativas (p<0.0001) entre portainjertos, siendo Troyer quien presenta los mejores resultados (Figura 5); esto sugiere que este patrón es más dependiente a la presencia de HMA dado sus características morfológicas; las diferencias con Carrizo probablemente son debido a la genética del hospedador y/o su interacción con la especie de HMA.

González-Mancilla et al. (2013) evaluaron a nivel de vivero el efecto de tipos y dosis de fertilizantes orgánicos aplicados al suelo en plantas del portainjerto Citrange Troyer encontrando resultados similares a los reportados en este estudio en cuanto materia seca foliar y radical.