El estudio fue descriptivo y se desarrolló en dos etapas. En la primera etapa se colectó muestras de tejido vegetal enfermo en plantaciones de café en los departamentos de Matagalpa y Jinotega. La segunda etapa consistió en el procesamiento de las muestras en el laboratorio de microbiología vegetal de la Universidad Nacional Agraria, ubicado en el km 12 ½ de la Carretera Norte en Managua, cuyas coordenadas geográficas corresponden a 12°08’33” latitud Norte y 86°10’31” longitud Oeste.

Las fincas cafetaleras fueron seleccionadas por presentar antecedentes de enfermedades bacterianas. En el departamento de Matagalpa fue seleccionada la finca El Limón, mientras que en Jinotega las fincas fueron El Cairo, El Palacio, Los Potrerillos y Santa Maura. Se colectó un total de 30 muestras de tejido vegetal enfermo, que incluyeron hojas, bandolas, flores y frutos. El tipo de colecta fue selectiva o dirigida en plantas con posibles síntomas de enfermedad bacteriana y se realizaron anotaciones acerca de las características morfológicas de los síntomas. En cada finca se levantó el historial del cultivo (área cultivada, variedades, edad de la plantación, manejo fitosanitario, otros manejos agronómicos, temperatura y altitud).

Se describieron los síntomas de muestras de tejido colectadas. Estas fueron observadas al estereoscopio y se seleccionaron muestras con características de manchas bacterianas y presencia de exudados bacterianos. Posteriormente se realizó el proceso de aislamiento e identificación de género y especie de bacteria (Raimundi, 2013; Rivero, 2017).

El proceso de identificación de las bacterias fitopatógenas consistió en el aislamiento de las bacterias en tejido vegetal enfermo; se utilizó la técnica de inducción al crecimiento bacteriano. Se realizaron pruebas bioquímicas, para identificación de especies de bacterias y prueba de reacción de hipersensibilidad en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.) por ser una especie no huésped de baterías que afectan al cultivo de café, y de esta mamera comprobar la patogenicidad de las bacterias identificadas.

La técnica de inducción al crecimiento para el aislamiento de bacterias de tejido vegetal enfermo consistió en la realización de cortes de 5 mm de tejido vegetal con síntomas de enfermedad bacteriana y se desinfectó con hipoclorito de sodio al 0.5 % y alcohol histológico al 95 %, posteriormente se lavó con agua destilada estéril y se realizó secado en superficie de papel filtro estéril, se sembró en cinco platos por muestra y cinco cortes por plato en medio agar nutritivo (AN). Finalmente, los platos se sellaron con Parafilm y rotulados con la debida información (Gutiérrez, 2012).

La identificación de géneros de bacterias fitopatógenas se realizó a partir cultivos puros de colonias bacterianas, con crecimiento de 24 horas; esta consistió, en observar las características morfológicas de crecimiento de colonias bacterianas que incluyen forma, color, aspecto y presencia de pigmentos fluorescentes en medio agar Pseudomonas (King B). Se realizaron las pruebas de hidróxido de potasio al 3 % (KOH al 3 %), oxidasa y Tinción Gram. Para identificación de especies se realizaron las pruebas de producción de ácidos a partir de sorbitol, celobiosa, trehalosa, sacarosa (Schaad, 2001).

Para las pruebas de hipersensibilidad, se estableció un vivero de plántulas de tabaco. Las plántulas fueron inoculadas cuando alcanzaron un crecimiento entre 20 cm y 25 cm de altura. Por cada plántula se inoculó las bacterias previamente identificadas, un control positivo que consistió en la inoculación de Ralstonia solanacearum obtenido del laboratorio de microbiología de la Universidad Nacional Agraria (UNA) y un control negativo que consistió en la infiltración agua destilada estéril.

Se preparó una suspensión bacteriana de 1 x10^-8 a partir de cultivos puros con 48 horas de incubación. La inoculación se realizó en hojas totalmente expandidas, utilizando una jeringa hipodérmica, para infiltrar la suspensión bacteriana en los espacios intervenales. Las plántulas fueron irrigadas con agua destilada estéril y cubiertas con bolsas plásticas para crear condiciones de humedad. Se evaluó la reacción de hipersensibilidad positiva, mediante la observación de lesiones necróticas localizadas o la presencia de halos cloróticos amarillos a las 48 horas y 72 horas después de la inoculación (Raimundi, 2013).

Las bacterias que resultaron patogénicas fueron seleccionadas de acuerdo con la intensidad de la reacción de hipersensibilidad. Se utilizaron cuatro bactericidas de uso agrícola, estreptomicina más oxitetraciclina 16.5 WP, clorhidrato de oxitetraciclina 5 WP y ácido oxolínico 20 WP y sulfato de cobre 24 SC a diferentes dosis (Cuadro 1). Se utilizaron cuatro dosis por cada producto (dosis mínima de referencia, mínima recomendada, media y máxima recomendada en la etiqueta) con cinco repeticiones por dosis.

La dosis mínima de referencia es menor que la dosis mínima recomendada en la etiqueta del producto y se usó para conocer si las bacterias eran sensibles a esta dosis y de esta manera poder recomendarla para su utilización (Cuadro 1). Para la prueba de sensibilidad a antibióticos, se utilizó el método de Bauer et al, (1966). Este método consistió en preparar una suspensión bacteriana de turbidez 0.5 escala Mackfarland. Con un aplicador de madera punta de algodón humedecido con la suspensión bacteriana se inoculó el medio nutritivo (AN). Posterior a la inoculación se colocaron cuatro discos impregnados con los bactericidas a diferentes dosis y un disco impregnado con agua destilada estéril como testigo negativo.

Se realizó evaluación cualitativa de la sensibilidad a bactericidas en un periodo 24 horas. Consistió en la medición en milímetro del área o halo de inhibición de crecimiento bacteriano, causada por la dosis de bactericida como lo indica el Centro Nacional de Diagnóstico y Referencia (CNDR, 2004). Se consideran sensibles los aislados que no crecieron alrededor del disco impregnado con el bactericida produciendo halos de inhibición mayores de 14 mm, y resistentes los aislados bacterianos que presentaron crecimiento bacteriano alrededor del disco impregnados con el bactericida, mostrando halos de inhibición menores de 14 mm [Clinical and Laboratory Standards Intitute (CLSI, 2016)].

Cuadro 1.

WP: Polvo humectable, SC: Solución concentrada.

La información obtenida fue analizada de manera descriptiva. Los datos de sensibilidad a bactericidas fueron organizados en una base de datos en Microsoft Excel, luego fueron analizados con el programa estadístico InfoStat, en donde se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) y separación de medias con la prueba de Tukey (α= 0.05).

El área de las fincas donde se colectaron las muestras es mayor a 60 ha de café. El nivel tecnológico en relación con el uso de insumos es alto, en sistema de producción agroforestales. La fertilización está basada en análisis químico de suelo, manejo integrado de plagas, así como la aplicación de buenas prácticas agrícolas . La temperatura promedio en las fincas es de 25 ºC y la altitud promedio de 1 068 msnm. Generalmente estas fincas tienen establecido variedades de café Parainema, Marsellesa, Caturra, Pacamara y Catuaí. Las variedades establecidas en las fincas son adecuadas para las condiciones agroclimáticas.

Los síntomas en hojas causados por Pseudomonas, se observaron cómo manchas de coloración pardo-oscura, de forma irregular y rodeada por halo acuoso amarillo y traslucido, frecuentemente asociadas con manchas necróticas causadas por el complejo de hongos; Cercospora coffeicola (Berk & Cooke), Hemileia vastatrix (Berkeley & Broome) y Mycena citricolor (Berkeley & Curtis). En algunas muestras los síntomas se observaron manchas necróticas extendidas a lo largo de las nervaduras de las hojas (Figura 1). En bandolas se observaron manchas necróticas de forma irregular; generalmente las manchas se observaron en los entrenudos de las bandolas. En los brotes florales los síntomas fueron manchas pequeñas de coloración pardo-oscura, de forma y tamaño irregular (Figura 2).

Figura 1. Figura 1. Síntomas de manchas necróticas de color pardo-oscuro, de forma irregular, rodeada por halo acuoso amarillo y traslucido, causados por Pseudomonas spp en hojas de café.

Figura 2. Figura 2. Síntomas de manchas necróticas de color pardo-oscuro, de forma y tamaño irregular, causados por Pseudomonas spp en bandolas y flores de Café.

Rivero (2013) relaciona el daño de P. syringae con manchas foliares necróticas irregulares, de coloración marrón, rodeadas por un halo amarillento que pueden coalescer, formando grandes áreas necrosadas; reporta que los síntomas ocasionados por las diferentes especies de Pseudomonas a nivel de campo no mostraron diferenciación entre ellos, lo que dificulta su caracterización a nivel de especie.

Según Raimundi (2013), Rivero (2017), las diferentes especies bacterianas patógenas del café producen síntomas similares, razón por la cual la identificación de P. cichorii y P. syringae debe realizarse mediante pruebas bioquímicas y moleculares.

Las bacterias identificadas en las diferentes variedades de café mediante pruebas bioquímicas fueron Pseudomonas cichorii, Pseudomonas syringae y Pseudomonas corrugata. Estas mostraron reacciones positivas a la reacción con KOH 3 % y morfología de bacilos Gram negativos al observarlos al microscopio óptico con tinción Gram. La especie P. cichorii predominó en los crecimientos bacterianos, mientras que las especies P. syringae, se identificó en todas las variedades. La especie de P. corrugata, se identificó en las variedades Pacamara y Caturra (Cuadro 2). Las especies de P. syringae y P. cichorii produjeron pigmentación en el medio nutritivo y King B, la prueba de oxidasa fue positiva para las especies P. cichorii y P. corrugata, mientras que para P. syringae fue negativa. En el caso de las pruebas de carbohidratos P. syringae fue la que mostró capacidad de fermentar la Sacarosa y Trehalosa (Cuadro 3).

Cuadro 2. Cuadro 2. Bacterias fitopatógenas identificadas en variedades de café analizadas

Variedades de café	Bacterias
	P. syringae	P. cichorii	P.corrugata
Parainema	3	5	0
Marsellesa	1	4	0
Caturra	1	4	3
Pacamara	1	2	1
Catuaí	1	0	0
Total	7	15	4

Cuadro 3.

T.Gram: Tinción Gram, KOH: Hidróxido de potasio, (Oxi: Oxidasa, Cel: Celobiosa, Sac: Sacarosa, Sor: Sorbitol, Tre: Trehalosa, Benz: Benzoato, Símbolo (-): Negativo, Símbolo (+): Positivo, G: Gram.

Estudio realizado por Raimundi (2013) en relación con el diagnóstico de enfermedades bacterianas en el cultivo de café identificó mediante técnicas convencionales a las especies de P. syringae y P. cichorii en las variedades Catuaí y Mundo Nuevo. Otras investigaciones hacen referencia a la identificación de la especie P. syringae mediante morfología y crecimiento en medios cultivos selectivos, a partir de hojas de café (Rivero, 2017; Zoccoli et al., 2011).

Los aislados bacterianos identificados como de P. syringae, P. cichorii y P. corrugata, mostraron resultados positivos a la prueba de hipersensibilidad en tabaco, indicando patogenicidad para el cultivo de café (Figura 3). Estos resultados fueron similares a los obtenidos por Raimundi (2013), Belan et al. (2016), Rivero (2017), que determinaron la patogenicidad de las especies de Pseudomonas cichorii y syringae aisladas de tejido de café e inoculadas en hojas de plantas de tabaco. La especie P. corrugata no ha sido reportada afectando el cultivo de café, sin embargo, se ha registrado su patogenicidad en algunas solanáceas como tomate, tabaco, pimiento y berenjena (Silverio y López, 1994).

Figura 3. Figura 3. Reacción de hipersensibilidad en hojas de tabaco inducida por aislados bacterianos provenientes de tejido de café. (A) P. syringae., (B, E), P. cichorii, (C), Control negativo (D) Control positivo, (F) P. corrugata.

Se seleccionaron nueve aislados bacterianos tomando como criterio de selección la intensidad de la reacción en la prueba de hipersensibilidad en tabaco. Los aislados seleccionados fueron cuatro de P. cichorii, tres de P. syringae y dos de P. corrugata. Los antibióticos estreptomicina + oxitetraciclina 16.5 WP inhibió el crecimiento de los aislados bacterianos Pseudomonas cichorii (67F), Pseudomonas corrugata (PBP), Pseudomonas syringae (PAF). Sin embargo, no inhibió el crecimiento en los asilados bacterianos Pseudomonas cichorii (4A, 29B). El ácido oxolínico 20WP inhibió el crecimiento de los aislados bacterianos Pseudomonas cichorii (4A), Pseudomonas corrugata (PBP); sin embargo, no inhibió el crecimiento en los asilados bacterianos Pseudomonas cichorii (67F, 71C).

Clorhidrato de oxitetraciclina 5 WP inhibió el crecimiento de los aislados bacterianos Pseudomonas cichorii (67F), Pseudomonas syringae (PAF), sin embargo, no inhibió el crecimiento en los asilados bacterianos Pseudomonas cichorii (29B), Pseudomonas corrugata (PBP2). Sulfato de Cobre 24 SC no inhibió el crecimiento bacteriano del género Pseudomonas, indicando que las bacterias son resistentes al producto (Cuadro 4, Figura 4).

Cuadro 4.

Sensibilidad: No hay crecimiento alrededor del disco, Resistencia: Hay crecimiento alrededor del disco, no hay presencia de halo de inhibición

Figura 4. Figura 4. Halos de inhibición producidos por los bactericidas Clorhidrato de oxitetraciclina (A y C), Ácido oxolínico (D), Ausencia de inhibición bacteriana (B) por sulfato de cobre.

Schauffler y Di Piero (2017) determinaron que la dosis de 10 mg ml^-1 de estreptomicina + oxitetraciclina usado como testigo en Pseudomonas syringae aislada de tomate, presentó halos de inhibición de 16.2 mm, resultando sensible a dicho producto. Scheck y Pscheidt (1998) estudió cepas de P. syringae, pv. Syringae aisladas de plantas ornamentales y registró resistencia a estreptomicina y sulfato de cobre (CuSO₄) en ensayos in vitro. Zoccoli et al. (2011) indica que la posibilidad de que ocurran interacciones adversas entre metales como el cobre y el medio de cultivo son muy alta, existe la posibilidad de que en el medio de cultivo el cobre no esté disponible, lo que puede llevar a resultados inconclusos.

Las dosis de 240 g 200 L^-1, 260 g 200 L^-1 y 280 g 200 L^-1 superaron la dosis de referencia de 100 g 200 L^-1 para el caso de estreptomicina más oxitetraciclina (Figura 5); mientras que en el ácido oxolínico las dosis de 500 g 200 L^-1, 750 g 200 L^-1 y 1 000 g 200 L^-1 superan a la dosis de referencia de 100 g 200 L^-1 que produjo menores halos de inhibición (Figura 6). Los mejores resultados, para el caso de clorhidrato de oxitetraciclina se observaron en las dosis de 350 g 200 L^-1 y 500 g/200 L^-1 (Figura 7). En este estudio los datos de sensibilidad para sulfato de cobre no se ajustaron al modelo estadístico por no mostrar halos de inhibición, además se demuestra que las dosis mínimas para los productos estreptomicina más oxitetraciclina, ácido oxolínico y clorhidrato de oxitetraciclina producen los mismos efectos inhibitorios que las dosis máximas recomendadas para cada producto. El bactericida con ingrediente activo ácido oxolínico mostró mayor efecto de inhibición en el crecimiento bacteriano.

Figura 5. Figura 5. Dosis de estreptomicina más oxitetraciclina 16. 5 WP

Figura 6. Figura 6. Dosis de ácido oxolínico 20 WP

Figura 7. Figura 7. Dosis de clorhidrato de oxitetraciclina 5 WP

McManus y Jones (1994) afirman que la oxitetraciclina tiene un efecto bacteriostático y es menos efectiva que la estreptomicina, que tiene efecto bactericida, pero esta es más efectiva cuando se aplica para el manejo de cepas bacterianas que son resistentes a la estreptomicina.