La detección del agente causal del HLB se realizó en el Laboratorio de microbiología de la Universidad Nacional Agraria (UNA). El estudio de fluctuación poblacional del vector D. citri se efectuó en cuatro viveros ubicados en el municipio de Masatepe, departamento de Masaya, Nicaragua. Los sitios de los viveros seleccionados se encuentran a una altitud promedio de 455.41 metros sobre el nivel del mar (msnm) y presentan un clima tropical de sabana, con temperaturas promedios de 27.5 °C y precipitaciones anuales que oscilan entre 1 200 mm y 1 400 mm.

Se recolectaron muestras de hojas en cada uno de los viveros y se llevaron al laboratorio de microbiología de la UNA. Se seleccionaron hojas que presentaban síntomas típicos de la enfermedad, tales como: hojas con coloración amarillo pálido con áreas irregulares (asimétricas) de moteado difuso, con nervaduras engrosadas y aclaradas de aspecto corchoso (Coletta-Filho et al., 2004). Estas hojas se utilizaron para extraerles el ADN y posteriormente realizar la prueba de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Las plántulas tenían en promedio cuatro meses de edad en el momento que inició el estudio y ocho meses de edad al concluir éste. Se realizaron dieciséis recolectas de muestras en total por vivero (una muestra semanal × 4 meses) teniendo en cuenta que el patógeno tiene un largo período de incubación y de latencia (Gottwald, 2010). En cada mes por vivero, se tomaron 20 plántulas, de las cuales se tomaron las hojas con síntomas de HLB, para un total de 80 plántulas por vivero.

Para la extracción de ADN de tejido foliar se siguió el procedimiento de Hung et al. (1999) con una leve modificación, que consistió en no usar el reactivo Sarkosyl. En un recipiente de porcelana se depositaron aproximadamente 0.5 gramos de venas centrales y pecíolos; se agregaron 3 ml de buffer de extracción de ADN y se procedió a moler los tejidos con un mortero. La suspensión resultante se incubó a 65 °C por una hora; se centrifugó a 12 000 g (13 000 rpm) durante 10 minutos; se transfirieron 300 μl del sobrenadante a un nuevo tubo; se agregaron 100 μl NaCl 5M, 300 μl de CTAB al 2 % y 2 µl de ARN-asa y se mezcló uniformemente. Posteriormente se incubó a 65 °C por 10 min. Se adicionaron 600 μl de CI (cloroformo:alcohol isoamílico = 24:1) y se mezcló mediante inversión. Se centrifugó a 11 000 g (12 000 rpm) durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 1.5 ml. Se agregó 600 μl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico en una relación de 25:24:1 y se mezcló mediante inversión. Se centrifugó a 12 000 g (13 000 rpm) por 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo de 1.5 ml y se agregó 300 μL de isopropanol frío y se mezcló por inversión suave. Se incubó a -20 °C por 30 min, para luego centrifugar a 13 000 g (14 000 rpm) por 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y el precipitado se lavó con 200 μl de etanol al 70 %. Se centrifugó nuevamente a 14 000 rpm y se descartó cuidadosamente el etanol y el precipitado se dejó secar hasta que se evaporaron los residuos de etanol. El precipitado se resuspendió en 50 μl de buffer TE. El ADN resuspendido se almacenó a 4 °C.

Una vez finalizada la extracción de ADN de las hojas se continuó con el procedimiento de la PCR convencional y electroforesis. Se utilizaron el par de iniciadores desarrollados por Hocquellet et al. (1999), los cuales consisten en las siguientes secuencias: el iniciador de sentido rplA2 (TATAAAGGTTGACCTTTGGAGTTT) y el iniciador antisentido rplJ5 (ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA). Este par de iniciadores permiten distinguir las variantes asiáticas y africanas, ya que amplifican un fragmento de 703 pb (pares de base) para Ca. Liberibacter asiaticus (CLas) y de 669 pb para Ca. Liberibacter africanus (CLaf). Este par de iniciadores no amplifican las secuencias de la región 16S del ADN ribosomal de la bacteria, sino que están basados en genes proteicos (Operón ß) (Fujikawa e Iwanami, 2012). El protocolo de amplificación que se utilizó fue el descrito por Li et al. (2007) con leves modificaciones, las cuales se citan a continuación. Se realizó una desnaturalización inicial a 94 °C por tres minutos, seguido de 40 ciclos a 94 °C por 45 segundos, anillamiento a 53 °C por 45 segundos, extensión a 72 °C por un minuto y una extensión final de 72 °C por siete minutos. El producto PCR fue visualizado en agar al 1 %, al cual se le agregó 4 µl del reactivo GelRed para la tinción de los fragmentos de ADN.

Se colocaron diez trampas Delta Semiotrap color amarillo y se revisaron cada ocho días durante cuatro meses, para un total de 16 fechas de muestreo, y de esta manera se determinó la fluctuación poblacional del vector. También se recolectaron brotes de las plántulas para realizar el conteo de huevos, ninfas y en algunos casos hasta de insectos adultos de D. citri que se encontraban en los brotes. Asimismo, la fluctuación poblacional del vector se relacionó con el número de aplicaciones de insecticidas.

Porcentaje de detección del HLB mediante PCR en muestras de hojas por vivero; número de adultos de D. citri capturados por trampa; número de brotes totales por planta; número de huevos, ninfas y adultos por brote nuevo; número de aplicaciones de insecticidas.

En el caso de la detección de CLas en tejido vegetal mediante la PCR, se realizó una descripción porcentual de los casos positivos por vivero. Para el análisis de los datos de fluctuación poblacional se realizó un análisis gráfico descriptivo de la fluctuación de adultos y una correlación entre los estadios de huevo, ninfas y adultos y el número de brotes nuevos por plántula en cada vivero. En el caso específico de los adultos, se realizó un análisis de varianza (ANDEVA) tomando como repetición las fechas de muestreo y se usó el software estadístico InfoStat (2008). Las medias se compararon mediante la prueba de Tukey (α = 0.05).

En los cuatro viveros se detectó la presencia de HLB a través de la prueba de PCR. El porcentaje de detección de Ca. Liberibacter asiaticus fue variable en los cuatro viveros durante los cuatro meses que se recolectaron muestras (Cuadro 1). En los viveros donde se detectaron más casos de HLB fueron en Campos Azules 1 y en el vivero El Román (cuatro casos positivos de 16 muestras analizadas mediante PCR), el porcentaje de detección en estos viveros fue de 25 %, mientras que en los viveros Campos Azules 2 y El Diamante el porcentaje fue de 12.5 %, ya que de 16 muestras analizadas en los cuatro meses se detectaron solamente dos casos positivos de HLB (Cuadro 1).

Cuadro 1.

NMAPM = Número de muestras analizadas por mes.

Aunque el estudio abarcó un período de cuatro meses (febrero-mayo 2017), solamente en dos meses (marzo y mayo) se detectó la presencia del agente causal del HLB en las muestras analizadas a través de PCR (Figura 1). En el mes de marzo, la enfermedad fue detectada inicialmente en muestras tomadas de los viveros Campos Azules 1 (Figura 1, Panel A, carril 2), El Román (Figura 1, Panel B, carriles 10 y 11) y Campos Azules 2 (Figura 1, Panel B, carril 12). En el mes de mayo, el HLB fue detectado en todas las muestras analizadas de los cuatro viveros. Los casos positivos de HLB se registraron en el vivero El Diamante (Figura 1, Panel C, carril 2), vivero Campos Azules 2 (Figura 1, Panel C, carril 4) y Campos Azules 1 (Figura 1, Panel C, carriles 5 y 6). En la Figura 1 (Panel D), se observan casos positivos en el vivero El Román (carriles 7 y 8), El Diamante (carril 9) y Campos Azules 1 (carril 13). Los marcadores rplA2 (iniciador de sentido) y el rplJ5 (iniciador de antisentido) amplificaron un fragmento de 703 pares de bases (pb), confirmando que la variante Ca. Liberibacter asiaticus es la que estuvo presente en los cuatros viveros donde se realizó el estudio (Figura 1). De esta manera, se descarta la posibilidad de que la variante Ca. Liberibacter africanus esté presente en la zona de estudio.

La región intergénica entre los genes rplA y rplJ es 34 pb más grande en Ca. Liberibacter asiaticus que en Ca. Liberibacter africanus. Con el iniciador de sentido f-rplA2, seleccionado en el gen rplA, y el iniciador de antisentido r-rplJ5 del gen rplJ, se amplifica un fragmento de ADN de 703 pb en Ca. Liberibacter asiaticus, mientras que para Ca. Liberibacter africanus se obtiene un fragmento de ADN de 669 pb (Arredondo et al., 2016; Bové, 2006).

En general, la detección del agente causal del HLB en los viveros fue errática durante el período de estudio, lo que se atribuye al hecho de que la bacteria provoca una infección sistémica difusa en los tejidos de la planta afectada. La naturaleza discontinua de la infección sistémica inducida por Ca. Liberibacter asiaticus indica que la concentración bacteriana en algunas partes de la planta está por debajo del umbral de detección a través de PCR, sin embargo, esas partes aparentemente negativas a la PCR pueden estar infectadas, y aunque son visualmente asintomáticas, el floema en todo el árbol o plántula tiene suficiente carga bacteriana como para que el vector, D. citri, pueda adquirir y transmitir al patógeno (Ding et al., 2015; Gottwald, 2010).

Figura 1. Figura 1. Detección positiva de Candidatus Liberibacter asiaticus en marzo (Panel A y B) y mayo (Panel C y D) 2017. En el panel A, la única muestra positiva (carril 2) correspondió al vivero Campos azules 1 y en panel B, las muestras positivas corresponden al vivero El Román (carriles 10 y 11) y al vivero Campos Azules 2 (carril 12). Las demás muestras resultaron negativas. En el panel C, los casos positivos de HLB se registraron en el vivero El Diamante (carril 2), vivero Campos Azules 2 (carril 4), Campos Azules 1 (carriles 5 y 6). En el panel D, los casos positivos corresponden al vivero El Román (carriles 7 y 8), El Diamante (carril 9) y Campos Azules 1 (carril 13). C+ = control positivo, C- = control negativo y M = marcador molecular de 100 pb, A, B, C y D son los paneles.

Por un lado, se ha estimado que en plantaciones de cítricos con árboles de 7-10 años, el período de incubación es de 1 a 2.5 años. Sin embargo, en plantaciones más jóvenes, el período de incubación se estima que es de 6-12 meses (Gottwald, 2010). Existen reportes que indican que el período de latencia es de aproximadamente 15 días (Lee et al., 2015). En el presente estudio, el agente causal del HLB fue detectado en plántulas injertadas de 6 y 8 meses de edad. La temprana detección de la enfermedad en las plántulas injertadas plantea dos alternativas en este estudio: i) las yemas, con las cuales se realizó el injerto estaban contaminadas con la bacteria y provenían de sitios donde la enfermedad está presente, pero todavía no está reportada oficialmente; ii) las plántulas fueron infectadas por insectos adultos de D. citri que portaban la bacteria.

La primera alternativa puede tener más aceptación, ya que se ha comprobado que mediante injertación los períodos de incubación y de latencia son más cortos. Por ejemplo, Ahmad et al. (2010) reportan que observaron síntomas de HLB a las 12-16 semanas después de haber injertado yemas infectadas con Ca. Liberibacter asitiacus en plántulas de mandarina de tres meses de edad. Además, algunas investigaciones en las cuales se ha hecho uso de la PCR para estudiar la capacidad de transmisión de Ca. Liberibacter asiaticus a través del psílido asiático de los cítricos (PAC) y a través de injerto, han demostrado que el PAC tuvo porcentajes de inoculación menos exitosos en las plantas huéspedes que la inoculación a través de injerto (Ukuda-Hosokawa et al., 2015).

La fluctuación poblacional de D. citri por vivero fue variable a través del tiempo. Los picos poblacionales más altos se observaron en el mes de abril con 17 y 26 insectos adultos capturados en el vivero Campos Azules 1 y El Román respectivamente (Figura 2). Estos resultados muestran la presencia de D. citri durante todo el periodo de evaluación, lo cual concuerda con lo reportado por Alemán et al. (2007) quienes mencionan que el psílido no tiene diapausa (estado fisiológico de inactividad), por lo tanto, el insecto siempre estará presente y sus poblaciones declinan en los periodos en que las plantas no están en brotación. Aun reportando picos poblacionales bajos en algunas de las fechas de muestreo en cada uno de los viveros en estudio, García et al. (2016) plantean que el hecho de poder presentar un potencial de 16 generaciones al año hace que su nivel de daño sea alto, con el agravante de que un nivel bajo poblacional no deja de ser preocupante para un insecto que sirve como vector del HLB.

Figura 2. Figura 2. Fluctuación poblacional de Diaphorina citri en cuatro viveros del municipio de Masatepe, Masaya, 2017.

No se encontró correlación estadística significativa entre los tres estadios del vector y el número de brotes nuevos en cada vivero. En el vivero El Román se registró el mayor número de individuos de los tres estadios de D. citri con un promedio de 28 huevos, 42 ninfas y 15 adultos, mientras que el promedio más alto de brotes se registró en los viveros El Diamante y El Román con 34 cada uno (Cuadro 2). Los resultados del presente estudio concuerdan con otros estudios donde no se ha encontrado una correlación significativa entre la densidad de adultos de D. citri y el número de brotes (Chávez-Medina et al., 2016).

Cuadro 2. Cuadro 2. Distribución numérica de brotes, huevos, ninfas y adultos de Diaphorina citri entre los cuatros viveros de cítricos incluidos en el estudio

Vivero	Brotes	Huevos	Ninfas	Adultos
El Diamante	34	7	15	5
Campos Azules 1	24	14	12	11
Campos Azules 2	23	7	12	7
El Román	34	28	42	15

Sin embargo, en este estudio se pudo constatar que el número de adultos tuvo una tendencia a la disminución cuando el número de brotes también disminuyó en el mes de abril (Figura 3). De tal manera, la presencia de brotes vegetativos jóvenes favorece la presencia de adultos del vector, los cuales ovipositan en estos brotes jóvenes donde posteriormente se desarrollan los huevos y ninfas, lo que también ha sido reportado por Ortega-Arenas et al. (2013).

Figura 3. Figura 3. Número promedio de los diferentes estadios de Diaphorina citri y de brotes vegetativos según época de muestreo.

Los insecticidas más utilizados para el control de D. citri en los cuatros viveros fueron BIODie® (extracto de berberina, ricina, argemonina, terthienyl), Tigre® 25 EC (dimetoato + cipermetrina), Abamectina® 1.8 % EC y Cipermetrina® 25 EC (cipermetrina). Entre estos insecticidas, el más utilizado fue BIODie con un 80 % de uso. En los viveros donde se realizó una mayor cantidad de aplicaciones, las poblaciones de D. citri fueron más bajas. En los viveros El Diamante y Campos Azules 2, se realizaron 16 aplicaciones, coincidiendo con la baja presencia de D. citri (5 y 7 adultos respectivamente); seguido por el vivero El Román con ocho aplicaciones y un promedio de 15 capturas y en menor frecuencia el vivero Campos Azules 1 con seis aplicaciones y un total de 11 adultos capturados (Figura 4).

En los últimos años se han propuesto estrategias para controlar a D. citri, sin embargo, el control químico es el método que ha mantenido más bajas las poblaciones del insecto (Ruiz-Galván et al., 2015). El control químico se dirige principalmente hacia el vivero, plantaciones de fomento y plantaciones jóvenes, puesto que los árboles maduros soportan mejor los daños causados por el vector (Alemán et al., 2007). En los viveros donde se realizó una mayor cantidad de aplicaciones, las poblaciones de D. citri fueron más bajas, por lo tanto, es notorio el efecto que tienen las aplicaciones de plaguicidas sobre la reducción en las poblaciones de D. citri (Figura 4). Sin embargo, el momento, la elección de los productos y los métodos de aplicación durante la temporada de crecimiento están lejos de ser estándar. Se deben tener en cuenta factores como la eficacia, la presión del vector, la disponibilidad de equipos, la conservación de insectos benéficos y el manejo de la resistencia (Qureshi et al., 2014).

Figura 4. Figura 4. Comparación del número de aplicaciones de insecticidas y el número total de adultos capturados por trampa en los viveros en estudio.