El estudio se realizó en el laboratorio de microbiología de la Dirección de Ciencias Agrícolas de la Universidad Nacional Agraria (UNA), ubicado en las coordenadas 12°08'45" de latitud Norte y 86°09'46" de longitud Oeste, en Managua, capital de Nicaragua.

Se trabajó mediante un diseño completamente aleatorizado (DCA) con arreglo unifactorial, con sietes tratamientos y cinco repeticiones por tratamiento. Cada unidad experimental correspondió a un plato Petri. Para todos los tratamientos se utilizó el medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) con formulación de 39 g L^-1 de agua destilada. Los tratamientos fueron conformados por las dosis comerciales indicadas para ácido piroleñoso y Azoxystrobin 20 % + Ciproconazol 8 %.

La colecta del material vegetativo infestadas con los hongos Colletotrichum sp y Cercospora sp, se realizó en la finca ITAMAR, ubicado en el departamento de Masaya, municipio de Masatepe con latitud Norte de 11°52´11.2´´ y longitud Oeste de 86°0.9´26.6´´; las muestras se colectaron en tres parcelas productivas y en áreas donde se observaron los síntomas característicos producidos por estos géneros. El material colectado se trasladó en un termo con hielo (hielera) y se almacenó en refrigeración, para el posterior proceso de aislamiento de hongos en el laboratorio.

Se procesaron muestras de hojas de café colectadas de campo con manchas con centro blanquecino, borde café y halo amarillento denominadas como mancha de hierro, ocasionadas por Cercospora sp, mientras que los síntomas de la enfermedad conocida como antracnosis son producidos por Colletotrichum sp y consisten en manchas necróticas de color café de tamaño y forma irregular que inician en el borde y avanzan hacia el centro (Huaman et al, 2021; Moreira et al, 2023). En las hojas con síntomas provocadas por estos hongos, se realizaron cortes de 0.3 cm², el material vegetativo se desinfectó con etanol al 90 % por dos minutos, luego se adicionó agua destilada para eliminar el etanol y se procedió a secar por una hora aproximadamente sobre papel toalla estéril; transcurrido el tiempo, se sembró el material vegetal en placas Petri conteniendo el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa (PDA) y el medio Agar Agar (AA) (Castro, 2020; Agrios, 2005), seis días después de la siembra se realizaron las lecturas y a partir de la primera siembra se extrajeron las estructuras del patógeno y se sembraron nuevamente en medios de cultivo PDA, hasta obtener así cultivos puros; luego se identificaron con la clave de hongos imperfectos de Barnett y Hunter (1998). Estos cultivos fueron utilizados en la prueba de eficacia e inhibición de crecimiento radial.

Para evaluar la eficacia del ácido piroleñoso in vitro se inocularon las placas Petri con el medio PDA que contenía las dosis comerciales evaluadas (Cuadro 1), en el caso del ácido piroleñoso se disminuyó la dosis a partir de 100 ml y se aumentó la dosis a partir de los 200 ml en un rango de 50 ml por dosis. Los discos de 6 mm con los hongos correspondientes a Colletotrichum sp y Cercospora sp ya crecido a 25 ^oC de temperatura se colocaron en el centro de la placa Petri y se incubó hasta que se observó un avance del hongo y se marcó el punto de avance sobre los cuatro radios dibujados en la placa y se inició el estudio de crecimiento (Alburqueque y Gusqui, 2018). A intervalos de 12 horas se marcó y se midió el crecimiento hasta las 144 horas, para un total de 12 intervalos de mediciones de crecimiento radial, cada radio representó una observación (French y Herbert, 1982; Leyva et al. 2017; Moreno, 2000). La eficacia de los fungicidas en el control del patógeno se expresó como el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (PICM), para esto se empleó la fórmula descrita por Rodríguez et al. (2017):

Donde:

R1: Crecimiento radial (mm) del hongo en el testigo absoluto

R2: Crecimiento del hongo radial (mm) en interacción con el producto (testigo relativo)

Cuadro 1. Cuadro 1. Tratamientos evaluados según dosis y producto

Tratamiento	Dosis (ml 20 ml-1 agua)	Producto
T0*	0	Sin producto
T1	50	Ácido piroleñoso
T2	100	Ácido piroleñoso
T3	150	Ácido piroleñoso
T4	200	Ácido piroleñoso
T5	250	Ácido piroleñoso
T6	300	Ácido piroleñoso
T7**	50	Azoxystrobin 20% + Ciproconazol 8%®

*: Testigo absoluto (sin producto), **: Testigo relativo (formulación química).

Se calculó el crecimiento diametral de los hongos fitopatógenos en el medio PDA con las dosis de ácido piroleñoso, expresado en mm h^-1, basado en el modelo de calculó descrito por Caro y León (2014), quienes calculan el crecimiento micelial por regresión lineal del diámetro de los hongos contra el tiempo en la fase de crecimiento.

Para evaluar la eficacia del ácido piroleñoso se realizaron mediciones al crecimiento radial o micelial de los hongos y se midió la inhibición en el medio que contenía las dosis de ácido piroleñoso y los testigos. Las lecturas del crecimiento radial se realizaron cada 12 horas y se aplicó la fórmula de porcentaje de inhibición de crecimiento micelial (PICM).

El cálculo del porcentaje de eficacia se determinó en una hoja de cálculo Microsoft Excel 365 empresarial, mientras que el porcentaje de inhibición de crecimiento micelial (PICM) de los hongos fitopatógenos, se analizó en el Software estadístico InfoStat 2020 versión libre en el que se realizó la prueba de normalidad de Shapiro Wilk, posterior al análisis de normalidad, se procedió a realizar el análisis de varianza y separaciones de medias mediante Tukey α=0.05.

Las dosis de 250 ml, 300 ml y testigo relativo (Azoxystrobin 20 % + Ciproconazol 8 %) mostraron eficacia del 100 % sobre el crecimiento del hongo Colletotrichum sp (Figura 1). La dosis mínima de 50 ml no mostró eficacia sobre Colletotrichum sp, este creció sobre la superficie del medio PDA, mientras que las dosis de 100 ml y 150 ml mostraron porcentajes bajos de eficacia.

Para el caso de la eficacia del ácido piroleñoso sobre Cercospora sp, a partir de las dosis de 150 ml y el testigo relativo se presenta una eficacia del 100 % (Figura 2). La eficacia más baja y en orden descendente se registró con las dosis de 100 ml y 50 ml.

Figura 1. Figura 1. Eficacia de inhibición del ácido piroleñoso sobre el hongo Colletotrichum sp según dosis

Figura 2. Figura 2. Eficacia de inhibición del ácido piroleñoso sobre el hongo Cercospora sp según dosis

Hongyin (2024) menciona que el ácido piroleñoso o vinagre de madera con una composición compleja puede alterar la permeabilidad de la membrana celular del hongo patógeno e inhibir la tasa de división o la síntesis proteica de Fusarium graminearum, lo que provoca la exudación de proteínas, carbohidratos, sodio y potasio o la inducción de trastornos metabólicos, haciéndolo eficaz para enfermedades fúngicas en plantas.

Gayatri (2019), reporta que el ácido piroleñoso presentó eficacia de inhibición para los hongos Trametes vesicolor (hongos descomponedor de la madera), Aspergillus fumigatus y Aspergillus niger, además menciona que la inhibición fúngica es causada por la propiedad antioxidante de los fenólicos

Según Lescay (2024), el ácido piroleñoso logra inhibir el crecimiento de algunos hongos patógenos como: Rhizoctonia solani, Sclerotium oryzae, Helminthosporium mayis, Pythium sp., Colletotrichum gloeosporioides y Cucurbitarum choanephora y algunas bacterias como: Xanthomonas campestris pv. Citri y Erwinia carotovora pv. Carotovora.

En las dosis de 50 ml con el ácido piroleñoso y el testigo absoluto (sin producto) el hongo Colletotrichum sp alcanzó un crecimiento de 40 mm, mientras que en la dosis de 100 ml el patógeno presentó un crecimiento de 33.45 mm, con la dosis de 150 ml el patógeno creció 28 mm. En la dosis de 200 ml Colletotrichum sp alcanzó un crecimiento de 9.05 mm, sin embargo, las dosis de 250 ml, 300 ml y el testigo relativo presentaron mayor inhibición con 4 mm (Figura 3).

La inhibición del ácido piroleñoso sobre Cercospora sp, con la dosis de 50 ml fue de 25 mm, seguido de la dosis de 100 ml que presentó una inhibición de 9.75 mm, con las dosis de 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml y el testigo relativo, la inhibición (menor crecimiento) fue de 4 mm, por lo tanto, estas dosis presentaron la mejor inhibición. El testigo absoluto fue el único tratamiento que no presentó inhibición creciendo 40 mm (Figura 4).

Figura 3. Figura 3. Inhibición de crecimiento radial del ácido piroleñoso sobre Colletotrichum sp según dosis.

Figura 4. Figura 4. Inhibición de crecimiento radial del ácido piroleñoso sobre Cercospora sp según dosis.

El ácido piroleñoso mostro eficacia a diferentes dosis, exceptuando las más bajas y manifestando actividad inhibitoria sobre los hongos Colletotrichum sp y Cercospora sp, causantes de manchas foliares en el cultivo de café que afectan la fotosíntesis y repercute en la producción.

Según Navas (2003) el ácido piroleñoso presenta toxicidad en concentraciones altas para los hongos pudridores de la madera Coriolopsis polizona, Fomitella supina, Pycnoporus sanguineus y Trametes villosa; mientras que Pertile y Frac (2023) obtuvieron un efecto inhibidor in vitro sobre el crecimiento del hongo Botrytis cinerea a diferentes concentraciones de ácido piroleñoso, exceptuando las concentraciones bajas.

Qin et al. (2010), indican que la actividad antimicrobiana del ácido piroleñoso se atribuye a la presencia de compuestos fenólicos, carbonilos y ácidos orgánicos además mencionan que diferentes ácidos piroleñosos exhiben actividades inhibidoras en fitopatógenos como Phytophthora capsici, Colletotrichum orbiculare, Valsa mali, Cochliobolus sativus, Helmintosporium sativum y Phytophthora infestan, con distintos grados de concentración.

Chalermsan y Peerapan (2009) determinaron que el ácido piroleñoso logro inhibir el crecimiento de algunos hongos patógenos en PDA como Rhizoctonia solani, Sclerotium oryzae, Helminthosporium mayis, Pythium sp., Colletotrichum gloeosporioides y Choanephora cucurbitarum, así como el de las bacterias patógenas de plantas tales como Xanthomonas campestris pv. citri y Erwinia carotovora pv. carotovora.