La papa (Solanum tuberosum L.) constituye una fuente de alimentación para los humanos y es un componente esencial en la dieta de los nicaragüenses. Para garantizar la sostenibilidad agrícola y la seguridad alimentaria, es crucial desarrollar alternativas biológicas que permitan optimizar los rendimientos del cultivo, reducir los costos de producción y mitigar el impacto ambiental. En este contexto, la simbiosis micorrícica arbúscular se posiciona como un tema central, ya que la funcionalidad de los hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) son necesarios para contribuir con la salud del suelo y la nutrición vegetal.

A pesar de su importancia, la producción de papa en regiones clave de Nicaragua (Estelí, Jinotega y Matagalpa) enfrenta diversas limitaciones como el uso excesivo de insumos y fertilizantes químicos, problemas fitosanitarios y condiciones climáticas adversas. Este mal manejo intensivo ha provocado una disminución significativa en la presencia y funcionalidad de los HFMA nativos en el suelo, lo que afecta negativamente la capacidad de las plantas para establecer simbiosis, aspecto que disminuye la absorción de nutrientes y la resistencia al estrés (Swaminathan y Verma, 1977).

La bioprospección de hongos formadores de micorrizas arbusculares se establece como una metodología esencial para identificar y aprovechar las cepas fúngicas locales adaptadas a las condiciones agroecológicas específicas de una zona determinada; sin embargo, para que este proceso sea efectivo, es necesario superar los desafíos técnicos en el manejo in vitro de estos organismos. Específicamente, se requiere la optimización de protocolos para la desinfección de las esporas y la evaluación de su viabilidad, ya que los métodos tradicionales a menudo resultan en altos niveles de contaminación o en una baja tasa de germinación, lo que limita la obtención de propágulos infectivos puros para su multiplicación.

El uso de micorrizas nativas se presenta como una alternativa sostenible. Los HFMA identificados mediante bioprospección no solo mejoran la nutrición mineral de las plantas (especialmente fósforo), sino que también contribuyen a reducir la dependencia de insumos químicos, aumentar el rendimiento y fortalecer la resiliencia del cultivo de papa frente a enfermedades y estrés hídrico (Azcón-Bieto y Talón, 2008).

Esta investigación tiene como objetivo optimizar métodos de desinfección y germinación de esporas de hongos formadores de micorrizas arbusculares, para el desarrollo de protocolos de bioprospección in vitro que fortalezcan la producción de semilla de papa de alta calidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Tipo de investigación

El presente estudio corresponde a una investigación de tipo experimental, con un enfoque cuantitativo y alcance descriptivo-exploratorio, de acuerdo con las clasificaciones metodológicas estándar (Hernández Sampieri et al., 2014).

Muestreo de suelo y material vegetal

El muestreo se realizó en dos fincas productoras de papa en el departamento de Estelí, al Norte de Nicaragua, ubicado a 107 km de su capital Managua. Se muestrearon cuatro lotes: finca Los Córdobas (lote con las variedades Picasso y Panamera) y finca La Fortuna (lote con las variedades Memphis y Sylvana), con edades entre 35 y 50 días. El muestreo se realizó al azar en un área de 50 m² en el que se seleccionaron cinco plantas con raíces incluyendo el suelo, todo colectado a una profundidad de 20 cm. La muestra del suelo fue de aproximadamente de 500 gramos.

Ubicación del estudio

La optimización de las metodologías de desinfección y germinación de esporas de los HFMA se realizaron en los laboratorios de Nematología, Microbiología, Química y Biología Molecular de la Universidad Nacional Agraria (UNA), localizados en el km 12.5 Carretera Norte, en Managua, en las coordenadas 12º08’36” de latitud Norte y 86º 09’49” de longitud Oeste.

Extracción e identificación de HFMA en suelo

Las esporas de hongos formadores de micorrizas arbusculares (HFMA) nativas de suelo se extrajeron a través del método de tamizado y decantación propuesto por Gerderman y Nicolson (1963); y el método de centrifugación en sacarosa modificado por Brundrett et al. (1996). La extracción consistió en pesar 10 g de suelo adicionándose 100 ml de agua destilada mientras la muestra era agitada manualmente. Después de 30 segundos de sedimentación, el sobrenadante se filtró secuencialmente a través de tamices de 500, 250 y 25 micras y se recolectó en tubos Falcón de 50 ml. La muestra colectada en el tubo se centrifugó a 3 400 rpm durante cinco minutos, se eliminó el sobrenadante y se agregó 15 ml de sacarosa al 70 % (p/v). Luego se centrifugó a 3 400 rpm por cinco minutos, el sobrenadante se pasó por el tamiz de 25 micras y se enjuagó con abundante agua, al final la muestra (esporas con agua) se colectó en una placa de Petri para su visualización en el estereoscopio.

Identificación de estructuras micorrícicas en raíces

Para la identificación de estructuras de hifas, vesículas y arbúsculas de HFMA se utilizó el método de despigmentación y tinción de raíz modificado por Phillips y Hayman (1970). Se seleccionaron raíces finas de aproximadamente 1 cm de longitud, se lavaron con agua potable y se colocaron en tubos Falcón de 50 ml, se agregó KOH (hidróxido potasio) al 10 % (v/v) y se colocaron en baño maría a 60 °C por 30 minutos. A continuación, se agregó H₂O₂ (peróxido de hidrógeno) al 10 % (v/v) y se colocó nuevamente en baño maría por 15 minutos, luego se cubrieron con azul de tripano al 0.05 % (p/v) y se colocó en baño maría por 25 minutos; finalmente se lavaron con agua destilada y se les añadió lacto glicerol.

Desinfección de HFMA

La desinfección de esporas de HFMA es un paso esencial para eliminar contaminantes superficiales (bacterias y hongos saprófitos). Esto garantiza la esterilidad necesaria para el cultivo monoxénico in vitro, permitiendo evaluar la viabilidad de la cepa pura. Para la desinfección, se utilizaron las esporas aisladas de las muestras de suelo. Se compararon tres metodologías de desinfección (Cuadro 1), basadas en los protocolos propuestos por Cranenbrouck et al. (2005), Moose (1962). No obstante, debido a la baja abundancia de esporas observada en los géneros Scutellospora spp y Gigaspora spp durante la cuantificación inicial, el material biológico disponible fue insuficiente para evaluar la metodología tres en estos géneros. Por lo tanto, el tercer protocolo de desinfección se evaluó exclusivamente con esporas del género Glomus spp, el que resultó ser el más abundante en las muestras de suelo (con un promedio de 18 esporas por gramo de suelo) y cuya disponibilidad permitió realizar las réplicas experimentales requeridas.

Germinación de esporas

El éxito en la germinación de las esporas está en dependencia del proceso de desinfección. La germinación se evaluó en cuatro medios de cultivo con el fin de comprobar la capacidad de germinación de las esporas de HFMA, los medios de cultivos utilizados son los propuestos por Murashige y Skoog (1962) al 50 %; Man, Rogosa y Sharpe (MRS) y el medio mínimo (M) y como control (testigo), el medio Agar Agua.

Variables evaluadas

Densidad poblacional de esporas (número de esporas). Se registró mediante la cuantificación del número de esporas viables (vivas) y no viables (muertas) por gramo de suelo seco, con categorización por género de HFMA. La cuantificación se realizó inmediatamente después de la extracción de las esporas, a partir de la muestra compuesta por el suelo proveniente del área del sistema radicular de las cinco plantas colectadas por variedad, replicada tres veces. El conteo de esporas y viabilidad se determinó observando las características morfológicas bajo microscopio: las esporas viables se caracterizaron por un citoplasma intacto, denso y granuloso, mientras que las no viables presentaban citoplasma colapsado, vacuolizado o signos de deterioro.

Abundancia relativa de géneros de HFMA (%). Se determinó para establecer el perfil taxonómico predominante de la comunidad nativa en los lotes (variedades). Esta variable se calculó como el porcentaje de esporas vivas identificadas para cada género (Glomus, Gigaspora, Scutellospora) con respecto al número total de esporas vivas cuantificadas en la muestra de suelo. La identificación a nivel de género se realizó utilizando las claves morfológicas de la International Culture Collection of (Vesicular) Arbuscular Mycorrhizal Fungi (INVAM, 2024). El cálculo de la abundancia relativa (% AR) para cada género (i) se realizó según la metodología de cuantificación y caracterización taxonómica propuesta por Schenck y Pérez (1987), utilizando la siguiente fórmula:

Colonización de HFMA (número estructuras micorrícicas en raíces)

Se evaluó en las muestras de raíces, cuantificando la presencia de estructuras fúngicas típicas: hifas, vesículas y arbúsculos. La determinación se realizó mediante observación directa en un microscopio óptico con el objetivo 10X. Previamente, las raíces clarificadas y teñidas se colocaron en un portaobjeto, desde donde se seleccionaron aleatoriamente 10 segmentos de raíz por muestra. Cada segmento fue dividido en 10 fragmentos, resultando en la evaluación de 100 campos microscópicos por muestra. Para cada campo, se cuantificó la cantidad de hifas, vesículas y arbúsculos presentes al momento de la identificación de estructuras micorrícicas. Los datos cuantitativos de estas estructuras se utilizaron posteriormente para el análisis estadístico.

Desinfección de esporas (%)

El porcentaje de contaminación de las esporas de HFMA se registró para evaluar la efectividad de las diferentes metodologías de desinfección. La evaluación se realizó a los siete días después de la siembra en los medios de cultivo estériles contenidos en las placas de Petri e incubados a 25 °C. Se tomó en cuenta la presencia y desarrollo de contaminantes fúngicos (hongos y levaduras) y bacterianos, cuya fuente se asumió como originada directamente de la superficie de las esporas de micorrizas establecidas. El porcentaje de contaminación (% C) para cada metodología se calculó utilizando la siguiente fórmula:

Esporas germinadas en los medios de cultivo (%)

La viabilidad de las esporas de HFMA se evaluó registrando el porcentaje de germinación en el medio de cultivo in vitro. La evaluación se realizó a los siete días después de la siembra en las placas de Petri, monitoreando visualmente la emergencia del tubo germinativo de las esporas. El porcentaje de germinación (% G) se determinó mediante el conteo de las esporas germinadas con respecto al número total de esporas viables sembradas, siguiendo la metodología base establecida por Gerdemann y Nicolson (1963). La fórmula utilizada fue:

Análisis de datos

Las variables densidad poblacional de esporas en el suelo y colonización de HFMA en raíces fueron evaluadas utilizando un modelo lineal simple (análisis de regresión) en el que se consideró a las plantas como efectos aleatorios. El modelo completo consistió en el ajuste de todos los efectos principales e interacciones y se realizó comparaciones múltiples usando la prueba de Tukey (p ≤ 0.05). Todos los análisis fueron realizados con el software estadístico R (R Core Team, 2023). Las variables porcentaje de contaminación y de germinación de esporas se realizó de manera descriptiva por análisis de porcentajes utilizando el programa Excel (2023) de Microsoft Office 365 Empresarial.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Densidad poblacional de esporas (número de esporas)

Se registraron diferencias estadísticas en la densidad poblacional de esporas vivas en función del suelo cultivado con las variedades de papa. El suelo proveniente del lote establecido con la variedad Panamera presentó la mayor densidad de esporas vivas (Figura 1). En cambio, no se registraron diferencias en la cuantificación de las esporas muertas extraídas de los diferentes lotes (Figura 1), sugiriendo que la variabilidad se concentra en las esporas viables.

Figura 1.
Densidad poblacional de HFMA (esporas vivas y muertas) provenientes del suelo según variedades de papa.

La mayor densidad poblacional de esporas vivas en el suelo cultivado con la variedad Panamera es un resultado clave que se interpreta como una respuesta específica del hospedero, que favorece la esporulación de los HFMA nativos y que está estrechamente ligada a la composición y cantidad de exudados radiculares liberados por la planta hospedera (Tian et al., 2021; Upadhyay et al., 2022). Se ha documentado que la variación genética entre cultivares influye directamente en los metabolitos secundarios y las señales químicas exudadas por la raíz (Zhao et al., 2020). Es posible que la variedad Panamera libere un perfil de exudados (como flavonoides o ácidos orgánicos específicos) que estimula la esporogénesis (formación de esporas) de las cepas presentes, particularmente las del género Glomus spp, el cual fue el más abundante en el estudio. Esta especificidad en la señalización química puede ser el factor determinante detrás del incremento de inóculo viable en este lote.

Alternativamente, esta alta esporulación podría ser vista como un indicativo de estrés en el establecimiento de la simbiosis, en lugar de reflejar una alta eficiencia. El número elevado de esporas puede ser una respuesta fúngica para garantizar la supervivencia ante condiciones ambientales o nutricionales subóptimas (Camenzind et al., 2022; Dube y Dames, 2025), o un bajo suministro de carbohidratos en la raíz (Nehls, 2008). Por lo tanto, aunque la variedad Panamera induce una alta densidad de esporas vivas, la funcionalidad de la simbiosis debe ser verificada mediante la cuantificación de las estructuras de intercambio (arbúsculos) y la respuesta agronómica de la planta.

Abundancia relativa de géneros de HFMA (%)

De los géneros de HFMA identificados (Glomus spp, Gigaspora spp y Scutellospora spp.), Glomus spp fue el género predominante en todas las variedades (Cuadro 2), a excepción de la variedad Sylvana. La predominancia de Glomus spp en sistemas agrícolas se atribuye a su ciclo de vida rápido y a su mayor capacidad de esporulación en comparación con los géneros Scutellospora y Gigaspora. García-Apaza (2017), evaluó poblaciones de esporas micorrícicas en suelos cultivados con papa y reporta esporas viables (vivas) de los géneros Glomus spp, Scutellospora spp y Gigaspora spp.

La abundancia del género Glomus en este estudio coincide con los hallazgos de Zhang et al. (2021), Liu et al. (2021) y Adeyemi et al. (2019), quienes identificaron Glomus como el género dominante en la mayoría de los suelos agrícolas y naturales, con abundancias relativas que oscilan entre 42 % y 86 % del total de esporas. Scutellospora suelen ocupar el segundo y tercer lugar en abundancia, con valores típicos de 12 % a 24 % (Sakha et al., 2025), dependiendo del ambiente y el cultivo; mientras que Gigasporas, presentan abundancias relativas menores al 10 % (Malik et al., 2025; Sánchez et al., 2017).

Colonización de HFMA (número de estructuras micorrícicas en raíces)

La cuantificación de hifas fue significativamente diferente en las raíces de la variedad Picasso con respecto a las variedades Memphis y Silvana (Cuadro 3). No se registraron diferencias significativas en la cuantificación de las estructuras clave de intercambio y almacenamiento (arbúsculos y vesículas) entre las variedades. A pesar de esto, las estructuras tipo arbúsculos se presentaron en un número mayor que las vesículas en todas las muestras, lo que representa un buen estado funcional de la asociación micorrízica.

El arbúsculo es la estructura clave donde ocurre el intercambio bidireccional de nutrientes (fósforo hacia la planta y carbono hacia el hongo), caracterizándose por un ciclo de vida corto, con una vida media de 4 a 15 días (Khaliq et al., 2022; Luginbuehl et al., 2017; Rui et al., 2022); su cuantificación en este estudio sugiere que la simbiosis se encontraba en una fase metabólica activa de intercambio, típica de una planta en crecimiento y con demanda de nutrientes. En contraste, las vesículas son estructuras de almacenamiento de lípidos para la supervivencia del hongo (Saavedra et al., 2024), y suelen formarse en etapas tardías de la colonización o como respuesta a condiciones de estrés (Méndez-Gálvez et al., 2021). La menor presencia de vesículas en relación con las otras estructuras micorrícicas en las raíces de papa, indica que el sistema radicular no se encontraba predominantemente en una fase de supervivencia o almacenamiento, sino en una fase de colonización funcional activa.

Desinfección de esporas HFMA (%)

La efectividad de las metodologías de desinfección varió significativamente según el género de HFMA (Figura 2). Debido a la limitación en el número de esporas viables de los géneros Gigaspora spp y Scutellospora spp, la efectividad de la metodología 3 se evaluó exclusivamente en Glomus spp. Los resultados indican que el género Glomus spp fue el más resistente a la desinfección, con una contaminación inicial de 100 % con la metodología 1, que se redujo al 30 % con la metodología 3. Los géneros Gigaspora spp y Scutellospora spp respondieron mejor a las metodologías de desinfacción; Gigaspora spp redujo la contaminación en 50 % con la metodología 2 respecto a la metodología 1 (de 80 % a 40 %), mientras que Scutellospora spp reduce la contaminación en un 42.8 % con la metodología 2 respecto a la metodología 1.

La descontaminación incompleta de esporas de Glomus spp., incluso tras tratamientos rigurosos, se debe principalmente a la presencia de bacterias incrustadas dentro de las capas externas de la pared esporal, que quedan protegidas de los agentes descontaminantes. Estas bacterias no son eliminadas por tratamientos superficiales y solo se detectan cuando las esporas se cultivan en medios apropiados (Bharadwaj et al., 2008; Roesti et al., 2005). A diferencia de otros géneros, la pared esporal de Glomus spp. puede ser más compleja en cuanto a la disposición y composición de sus capas (Bharadwaj et al., 2008; Maia y Kimbrough, 1998); además, la edad de la espora y el estado de maduración influyen en la eficacia de la descontaminación; esporas maduras requieren tratamientos más intensos, sin embargo, pueden afectar negativamente la viabilidad (Stürmer y Morton, 1997).

La capacidad de obtener esporas viables y parcialmente desinfectadas sienta las bases para el trabajo in vitro. Pérez et al. (2011) lograron obtener una alta germinación y 0 % de contaminación en esporas de Glomus sp., después de dos semanas de incubación, lo que demuestra que la asepsia completa es alcanzable si se optimizan las concentraciones y los tiempos de exposición de los agentes desinfectantes. El resultado del 30 % de esporas de Glomus spp., contaminadas, sugiere que la concentración o el tiempo de exposición de la metodología 3 necesita ajustes para aumentar su efectividad. La contaminación inicial de 100 % observada con la metodología 1, se justifica por el principio expuesto por Walley y Germida (1996), quienes indicaron que evitar medios ricos en nutrientes es clave para la descontaminación efectiva de HFMA. La metodología 1 utilizó el medio Murashige y Skoog (MS), que es inherentemente rico en nutrientes y aminoácidos, creando un ambiente propicio para el crecimiento explosivo de los contaminantes fúngicos y bacterianos adheridos a las esporas, lo que resultó en la contaminación total de la muestra.

Figura 2.
Porcentaje de esporas contaminadas según metodología de desinfección y géneros de micorrizas.

Esporas germinadas en los medios de cultivo (%)

Se evaluó la capacidad germinativa de Glomus spp., en cuatro medios de cultivo: ½ MS, medio mínimo (M), medio MRS y Agar Agua (control). La germinación de esporas ocurrió únicamente en el medio mínimo, con cinco esporas germinadas (Figura 3); aunque la germinación fue baja, el porcentaje de esporas viables fue mayor en el medio mínimo (89 %) comparado con MRS, ½ MS y Agar Agua.

Figura 3.
Número de esporas vivas y germinadas a los siete días en diferentes medios de cultivos.

La germinación de esporas a los siete días no presenta efecto significativo, sin embargo, se observó una tasa de germinación inicial de hasta cinco esporas germinadas a los siete días después de la siembra en las placas de Petri, una cifra esperable para una fase temprana de incubación. Este resultado es comparable con los hallazgos de Raghavendra et al. (2020), quienes reportaron de 0.20 % a 11.64 % de germinación en el mismo periodo, lo cual confirma que el proceso es intrínsecamente lento y que depende del medio de cultivo. Bécard et al. (1992); Scervino et al. (2005) indican que, para acelerar la germinación, es necesario incluir flavonoides en los medios de cultivos. Smith y Read (2008) destacan que el exceso de sales minerales puede inhibir la viabilidad y germinación de las esporas, lo que podría explicar el bajo número de esporas viables. La germinación y viabilidad de esporas en medios de cultivo puede ser limitada en la primera semana, especialmente si el inóculo proviene de suelos con baja diversidad o manejo intensivo (Esquivel-Quispe, 2020).

CONCLUSIONES

El protocolo de desinfección a base de Cloramina T más estreptomicina y gentamicina (Metodología 3) y el uso de medio mínimo (M) para la viabilidad y germinación, genera cultivos de esporas con bajos índice de contaminación, lo que es ideal para la obtención de inoculantes nativos de alta pureza.

El uso de medios de cultivos con altas concentración de sales actúa como un factor limitante para la germinación activa.

La baja presencia de estructuras micorrícicas funcionales como arbúsculos y vesículas en las raíces, se vincula a una fase metabólica activa de intercambio, típica de una planta en crecimiento y con demanda de nutriente.

Al contar con un protocolo que garantiza la desinfección de géneros clave como Glomus spp., es posible iniciar la producción de biofertilizantes axénicos de alta pureza, que permite al sector agrícola disponer de inóculos bioseguros (libres de patógenos) que optimicen la absorción de nutrientes y reduzcan la dependencia de fertilizantes químicos, mejorando la rentabilidad y sostenibilidad del cultivo de papa.

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